TF抗原及其类似物、和其化学酶法合成方法及其应用.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102796144 A (43)申请公布日 2012.11.28 C N 1 0 2 7 9 6 1 4 4 A *CN102796144A* (21)申请号 201210300710.7 (22)申请日 2012.08.22 C07H 5/06(2006.01) C07H 15/04(2006.01) C12P 19/26(2006.01) C12P 19/44(2006.01) A61K 39/385(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人山东大学 地址 250014 山东省济南市历下区文化西路 44号 (72)发明人曹鸿志 王凤

2、山 闫俊 (74)专利代理机构济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人邓建国 (54) 发明名称 TF抗原及其类似物、和其化学酶法合成方法 及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种TF抗原及其类似物、和其 化学酶法合成方法及其应用，方法包含下列步骤： （1）化学合成氟代半乳糖及氟代半乳糖胺类似物； （2）酶法合成氟代TF抗原；（3）酶法合成唾液酸 化Thomsen-Friedenreich抗原。本发明将化学 合成法的灵活性和酶合成法的高区域选择性和高 效性结合到一起，首次实现了氟代TF-抗原的酶 法合成，解决了目前化学合成氟代TF抗原中所面 临的底物反应活性低、合成步骤繁多、收率低

3、等不 足。由于氟代肿瘤相关糖抗原具有比天然糖抗原 更优越的药代性质，因而，本发明的在发展新型抗 肿瘤疫苗具有广泛的应用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书3页 说明书13页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 3 页 说明书 13 页 1/3页 2 1.通式所示的TF抗原及其类似物或通式所示的唾液酸化TF抗原及其类似物： 通式III 通式 其中： R 1 ，选自氢原子、-或-构型丝氨酸残基、-或-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷 基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、-或-构型取代烷基； R 2 ，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基； R 3 ，选自氮乙酰氨基、氮丙酰

4、氨基、氮三氟乙酰胺基、氮叠氮乙酰氨基； R 4 ，选自氟原子、羟基； R 5 ，选自氟原子、羟基； R 6 ，选自氟原子、羟基； R 7 ，选自氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基、叠氮； R 8 ，选自氟原子、羟基、叠氮。 2.一种权利要求1所述的TF抗原及其类似物的化学酶法合成方法，其特征是，包括以 下步骤： （1）选用通式所示的氟代半乳糖胺类似物或半乳糖胺类似物； 通式I 其中： R 1 ，选自氢原子、-或-构型丝氨酸残基、-或-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷 基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、-或-构型取代烷基； R 2 ，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基； R 3 ，选自

5、氮乙酰氨基、氮丙酰氨基、氮三氟乙酰胺基、氮叠氮乙酰氨基； 和选用通式所示的氟代半乳糖或半乳糖： 通式II 其中: R 4 ，选自氟原子、羟基； R 5 ，选自氟原子、羟基； R 6 ，选自氟原子、羟基； （2）利用一锅双酶法将通式和通式所示的化合物立体选择性偶联合成TF抗原及 其类似物，所述一锅双酶法中先后用到的酶分别为半乳糖激酶和己糖磷酸化酶； 权 利 要 求 书CN 102796144 A 2/3页 3 通式所示的TF抗原及其类似物： 通式III 其中： R 1 ，选自氢原子、-或-构型丝氨酸残基、-或-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷 基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、-或-构型取代烷基； R

6、2 ，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基； R 3 ，选自氮乙酰氨基、氮丙酰氨基、氮三氟乙酰胺基、氮叠氮乙酰氨基； R 4 ，选自氟原子、羟基； R 5 ，选自氟原子、羟基； R 6 ，选自氟原子、羟基； （3）利用一锅双酶法合成唾液酸化TF抗原及其类似物，所述唾液酸化采用唾液酸及其 类似物，其中唾液酸的类似物为R 7 、R 8 取代的唾液酸，所述一锅双酶法唾液酸化中用到的酶 指唾液酸CMP-合成酶和唾液酸转移酶； 通式所示的唾液酸化TF抗原及其类似物： 通式 其中： R 1 ，选自氢原子、-或-构型丝氨酸残基、-或-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷 基、炔基取代烷基、巯基取代烷基；-或-构型取代烷基；

7、 R 2 ，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基； R 3 ，选自氮乙酰氨基、氮丙酰氨基、氮三氟乙酰胺基、氮叠氮乙酰氨基； R 4 ，选自氟原子或羟基； R 5 ，选自氟原子、羟基； R 6 ，选自氟原子、羟基； R 7 ，选自氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基、叠氮； R 8 ，选自氟原子、羟基、叠氮。 3.如权利要求2所述的合成方法，其特征是，步骤（1）中的氟代半乳糖胺类似物采用以 下方法合成：将半乳糖氨基盐酸盐与醋酐进行反应后，将其C-3，C-4位用2,2-二甲氧基丙 烷在樟脑磺酸催化下进行丙酮叉保护；将仅裸露6-位羟基的氮取代氨基半乳糖苷在微波 条件下进行氟代，脱保护后

8、即得。 4.如权利要求2所述的合成方法，其特征是，步骤（1）中的氟代半乳糖采用以下方法合 成：先将半乳糖的1,2-和3,4-位在丙酮中用浓硫酸催化进行丙酮叉保护，再在微波条件下 进行氟代，脱保护后即得。 5.如权利要求2所述的合成方法，其特征是，步骤（2）中的TF抗原及其类似物合成方 法是：将0.5-20当量的化合物I、1.0-10.0当量化合物II、0.5-20当量ATP、5-100mMMgCl 2 、 权 利 要 求 书CN 102796144 A 3/3页 4 10-500mM,pH 5.0-10.0的Tris-HCl缓冲液配制水溶液，然后添加半乳糖激酶；反应完成 后，将反应体系的pH值

9、调节至4.5-8.5并加入己糖磷酸化酶；待反应完成后，纯化即可直接 获得TF抗原及其类似物。 6.如权利要求2所述的合成方法，其特征是，步骤（3）中的唾液酸化TF抗原及其 类似物的合成方法：将1.0-10.0当量的化合物、0.5-20.0当量的唾液酸及其类似物、 0.5-20.0当量的CTP、5.0-100mM的MgCl 2 和10-500mM,pH 5.0-10.5的Tris-HCl缓冲液配 制水溶液，加入唾液酸CMP-合成酶和唾液酸转移酶，实现一锅双酶法唾液酸化；反应完成 后，纯化即可直接获得唾液酸化TF抗原及其类似物。 7.如权利要求5所述的合成方法，其特征是，所述一锅双酶法中先后用到的

10、酶分别是 E.coli K-12 galactokinase（GalK）和Bifidobacterium infantis D-galactosyl-1-3 -N-acetyl-D-hexosamine phosphorylase（BiGalHexNAcP)，反应时间为25分钟-35小时。 8.如权利要求6所述的合成方法，其特征是，所述一锅双酶法唾液酸化中用到的 酶是Neisseria meningitidis CMP-sialic acid synthetase(NmCSS)和Pasteurella multocida sialyltransferase 1(PmST1)，反应时间为5分钟-

11、30小时。 9.如权利要求2所述的合成方法，其特征是，所述的酶法合成中反应温度为0-37，转 速为0-240rpm；所述酶反应的停止方法是向反应中加入等体积的4无水乙醇并在4下 培育0-30分钟。 10.权利要求1所述的通式或通式在制备抗肿瘤疫苗中的应用。 权 利 要 求 书CN 102796144 A 1/13页 5 TF 抗原及其类似物、 和其化学酶法合成方法及其应用 技术领域 0001 本发明属于糖类药物领域，涉及糖类物质的化学酶合成方法，尤其涉及肿瘤相关 糖抗原及其类似物的化学酶法合成方法，还涉及所合成TF抗原和sT抗原及其类似物在药 物研发领域的应用。 背景技术 0002 目前研究表

12、明，在不同肿瘤组织的产生和发展过程中存在一种共有现象，即在肿 瘤细胞表面会过度表达异常的糖链结构，这些糖链结构被称为肿瘤相关糖抗原（TACAs）。 同一肿瘤组织会表达不同肿瘤相关糖抗原，同一肿瘤相关糖抗原也会分布于不同肿瘤 组织。这些肿瘤相关糖抗原与肿瘤发生、发展和预后都存在密切关联（D.H.Dube and C.R.Bertozzi,Nat.Rev.Drug Discov.,2005,4,477-488.;M.M.Fuster and J.D.Esko,Nat. Rev.Cancer.,2005,5,526-542）。以下是一些常见肿瘤相关糖抗原的结构。 0003 0004 常见肿瘤相关糖抗

13、原 0005 鉴于上述情况，肿瘤相关糖抗原被广泛的应用于抗肿瘤疫苗的研发并取得了长足 的进展。目前已有多个药物进入临床研究阶段并表现出了较好的药效活性（Astronomo,R. D.,Burton,D.R.,Nat.Rev.Drug Discov.,2010,9,308-324）。但是，目前应用的多数是天 然结构的肿瘤相关糖抗原。由于正常组织本身也会少量表达这些异常糖链结构，致使抗 肿瘤疫苗的研发存在以下两方面的挑战：一，机体免疫系统不能够对其产生足够强的免疫 应答；二，天然糖抗原会在生理条件下降解使得不能产生特异性的免疫反应（Z.W.Guo and Q.L.Wang,Curr.Opin.Ch

14、em.Biol.,2009,13,608-617）。 0006 面临上述两个挑战，科学家们将目光聚焦在了对糖链结构进行非天然修饰上。如 对肿瘤相关糖抗原进行氟代，生成硫苷、碳苷来替换天然的氧苷键等一系列方法被用于抗 肿瘤疫苗的研发（Y.Cheng,A.L.Guo and D.S.Guo,Curr.Org.Chem.,2010,14,977-999;X. 说 明 书CN 102796144 A 2/13页 6 J.Yuan and R.J.Linhardt,Cur.Top.Med.Chem.,2005,5,1393-1430;K.Pachamuthu and R.R.Schmidt,Chem.R

15、ev.,2006,106,160-187）。这一解决途径虽然取得成效，但是同时也带 来了合成上的挑战。由上述肿瘤相关糖抗原的常见结构及近年来的研究可知：肿瘤相关糖 抗原末端往往有唾液酸化修饰，并且过度唾液酸化也是肿瘤发生发展过程中细胞表面糖链 结构异常的特征之一（Ajit.Varki,Glycobiology，1993,3,2,97-130），而化学唾液酸化目 前仍然是糖化学合成中的一个难点。 0007 T-抗原不仅是表达量最高的肿瘤相关糖抗原之一，也在多种肿瘤相关糖蛋 白共有成分中表现出极高的过量表达，比如在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和肺癌过度 表达量近乎90%（W.M.Lin,U.Karst

16、en,S. Goletz,R.C.Cheng and Y.Cao,Int.J Exp. Pathol.,2011,92,97-105；S.E.Baldus,K.Engelmann and F.G.Hanisch,Crit.Rev. Cl.Lab.Sci.,2004,41,189-231）。近来，含有单氟代和双氟代取代的T-抗原的MUC 1糖蛋白类似物得以合成并在动物试验中表现出了强的免疫原性（M.Johannes,T. Oberbillig and A.Hoffmann-Roder,Org.Biomol.Chem.,2011,9,5541-5546;S.Wagner， C.Mersch and

17、 A.Hoffmann-Roder,Chem-Eur.J.,2010,16,7319-7330;C.Mersch,S. Wagner and A.Hoffmann-Roder,Synlet.t,2009,2167-2171;A.Hoffmann-Roder and M.Johannesy，Chem.Comm.,2011,47,9903-9905；T.Oberbillig,C.Mersch,S.Wagner and A.Hoffmann-Roder,Chem.Comm.,2012,48,1487-1489）。且有研究表明化合物的氟代会 增强药物的稳定性和生物利用度(J.Xue,V.Kumar,S

18、.D.Khaja,E.V.Chandrasekaran,R. D.Locke and K.L.Matta,Tetrahedron,2009,65,8325-8335;J.Xia,J.Xue,R.D.Locke,E. V.Chandrasekaran,T.Srikrishnan and K.L.Matta,J.Org.Chem.,2006,71,3696-3706)。 而目前限制T-抗原及其类似物和sT-抗原及其类似物的研究与应用的最大屏障是高效快 捷的化合物获取。 0008 虽然近年来，化学糖苷化获得了快速的进展；但依然没有一个统一有效地普适性 方法。由于T-抗原中含有l-3半乳糖苷键，化学法

19、合成需要进行反复的保护与脱保护操作 并且收率较低、立体选择性不高(H.Yu,V.Thon,K.Lau,L.Cai,Y.Chen,S.Mu,Y.Li,P.G.Wang and X.Chen,Chem.Comm.,2010,46,7507-7509)。而非天然的修饰又进一步加大了化学法 合成上的难度。而目前通过糖基转移酶来催化的酶法合却又面临以下几方面的困难：一是 反应往往需要价格昂贵的活性糖为中间体，二是反应的催化往往需要多酶体系，而相应酶 的获得又比较困难；三是该系列酶往往有较强的底物专一性，底物适用性窄难以耐受非天 然的修饰。sT-抗原中含有末端唾液酸化修饰。而九碳糖唾液酸由于其自身独特结构

20、，不 仅容易形成分子内氢键，且在C1位的羧基、C3位的脱氧、C7位的氮杂原子取代均降低了 糖环上的电子密度，使得唾液酸糖苷键的生成成为糖合成领域的经典挑战（Xi Chen.,Ajit Varki.,ACS Chem.Biol.,2010,5,2,163176）。因此，寻找一种快速、高效合成肿瘤相关糖 抗原的合成方法是目前亟待解决的问题。 发明内容 0009 本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种TF抗原及其类似物，它它 们的化学酶法合成方法。 0010 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案： 说 明 书CN 102796144 A 3/13页 7 0011 通式所示的TF抗原及其类

21、似物或通式所示的唾液酸化TF抗原及其类似物： 0012 通式III 0013 通式 0014 其中： 0015 R 1 ，选自氢原子、-或-构型丝氨酸残基、-或-构型苏氨酸残基、叠氮取 代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、-或-构型取代烷基； 0016 R 2 ，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基； 0017 R 3 ，选自氮乙酰氨基、氮丙酰氨基、氮三氟乙酰胺基、氮叠氮乙酰氨基； 0018 R 4 ，选自氟原子、羟基； 0019 R 5 ，选自氟原子、羟基； 0020 R 6 ，选自氟原子、羟基； 0021 R 7 ，选自氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基、叠氮； 0022

22、R 8 ，选自氟原子、羟基、叠氮。 0023 上述TF抗原及其类似物的化学酶法合成方法，包括以下步骤： 0024 （1）选用通式所示的氟代半乳糖胺类似物或半乳糖胺类似物； 0025 通式I 0026 其中： 0027 R 1 ，选自氢原子、-或-构型丝氨酸残基、-或-构型苏氨酸残基、叠氮取 代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、-或-构型取代烷基； 0028 R 2 ，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基； 0029 R 3 ，选自氮乙酰氨基、氮丙酰氨基、氮三氟乙酰胺基、氮叠氮乙酰氨基； 0030 和选用通式所示的氟代半乳糖或半乳糖： 0031 通式II 0032 其中: 0033 R 4 ，选自氟原

23、子、羟基； 0034 R 5 ，选自氟原子、羟基； 0035 R 6 ，选自氟原子、羟基； 0036 （2）利用一锅双酶法将通式和通式所示的化合物立体选择性偶联合成TF抗 原及其类似物，所述一锅双酶法中先后用到的酶分别为半乳糖激酶和己糖磷酸化酶； 0037 通式所示的TF（Thomsen-Friedenreich）抗原及其类似物： 说 明 书CN 102796144 A 4/13页 8 0038 通式III 0039 其中： 0040 R 1 ，选自氢原子、-或-构型丝氨酸残基、-或-构型苏氨酸残基、叠氮取 代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、-或-构型取代烷基； 0041 R 2 ，选自氟原

24、子、氢原子、叠氮、羟基； 0042 R 3 ，选自氮乙酰氨基、氮丙酰氨基、氮三氟乙酰胺基、氮叠氮乙酰氨基； 0043 R 4 ，选自氟原子、羟基； 0044 R 5 ，选自氟原子、羟基； 0045 R 6 ，选自氟原子、羟基； 0046 （3）利用一锅双酶法合成唾液酸化TF（Thomsen-Friedenreich）抗原及其类似物， 所述唾液酸化采用唾液酸及其类似物，其中唾液酸的类似物为R 7 、R 8 取代的唾液酸，所述一 锅双酶法唾液酸化中用到的酶指唾液酸CMP-合成酶和唾液酸转移酶； 0047 通式所示的唾液酸化TF（Thomsen-Friedenreich）抗原及其类似物： 0048

25、通式 0049 其中： 0050 R 1 ，选自氢原子、-或-构型丝氨酸残基、-或-构型苏氨酸残基、叠氮取 代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基；-或-构型取代烷基； 0051 R 2 ，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基； 0052 R 3 ，选自氮乙酰氨基、氮丙酰氨基、氮三氟乙酰胺基、氮叠氮乙酰氨基； 0053 R 4 ，选自氟原子或羟基； 0054 R 5 ，选自氟原子、羟基； 0055 R 6 ，选自氟原子、羟基； 0056 R 7 ，选自氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基、叠氮； 0057 R 8 ，选自氟原子、羟基、叠氮。 0058 所述步骤（1）中的氟代半乳糖胺类

26、似物采用以下方法合成：将半乳糖氨基盐酸盐 与醋酐进行反应后，将其C-3、C-4位用2,2-二甲氧基丙烷（DMP）在樟脑磺酸（CSA）催化下 进行丙酮叉保护；将仅裸露6-位羟基在微波条件下进行氟代，脱保护后即得。 0059 所述步骤（1）中的氟代半乳糖采用以下方法合成：先将半乳糖的1,2-和3,4-位 在丙酮中用浓硫酸催化进行丙酮叉保护，再在微波条件下进行氟代，脱保护后即得。 0060 所述步骤（2）中的TF抗原及其类似物合成方法是：化合物I与、化合物II、ATP（腺 嘌呤核苷三磷酸）的摩尔比为1：（1.0-10）：（1.0-10）（这里是比例，后面是具体值，二者不对 等，建议统一成具体的摩尔范

27、围值。下同），MgCl 2 （5-100mM）、Tris-HCl缓冲液（10-500mM,pH 5.0-10.0）配制水溶液，然后添加半乳糖激酶（GalK,H.Yu,V.Thon,K.Lau,L.Cai,Y.Chen,S. Mu,Y.Li,P.G.Wang and X.Chen,Chem.Comm.,2010,46,7507-7509.）；反应完成后，将反应 说 明 书CN 102796144 A 5/13页 9 体系的pH值调节至4.5-8.5并加入己糖磷酸化酶(HexGalNAcP，H.Yu,V.Thon,K.Lau,L. Cai,Y.Chen,S.Mu,Y.Li,P.G.Wang and

28、 X.Chen,Chem.Comm.,2010,46,7507-7509.)。待反 应完成后，纯化即可直接获得TF抗原及其类似物。 0061 添加半乳糖激酶后反应完成采用TLC(乙腈:水:醋酸=2:1:0.2)检测。加入己 糖磷酸化酶后反应完成采用TLC(乙腈:水:醋酸=2:1:0.2或乙酸乙酯:甲醇:水:醋酸 =4:2:1:0.1)检测。 0062 所述步骤（3）中的唾液酸化TF抗原及其类似物的合成方法：化合物、唾液酸 及其类似物、CTP（胞苷三磷酸）三者之间的摩尔比为1：（0.5-20）：（0.5-20）（这里是比 例，后面是具体值，二者不对等，建议统一成具体的摩尔范围值。下同），MgCl

29、 2 (5.0-100mM) 和Tris-HCl缓冲液(10-500mM,pH 5.0-10.5)配制水溶液，加入唾液酸CMP-合成酶 （H.Yu andX.Chen,Org.Lett.,2006,8,2393-2396.;H.Yu,H.A.Chokhawala,S.Huang and X.Chen,Nat.protoc.,2007,1,2485-2492.;K.Lau,H.Yu,V.Thon,Z.Khedri,M.E.Leon,B. K.Tran and X.Chen,Org.Biomol.Chem.,2011,9,2784-2789.）和一种唾液酸转移酶 （H.Yu,H.Chokhawal

30、a,R.Karpel,B.Wu,J.Zhang,Y.Zhang,Q.Jia and X.Chen,J.Am.Chem. Soc.,2005,127,17618-17619.;K.Lau,H.Yu,V.Thon,Z.Khedri,M.E.Leon,B.K.Tran and X.Chen,Org.Biomol.Chem.,2011,9,2784-2789.），实现一锅双酶法唾液酸化；反应完成后， 纯化即可直接获得唾液酸化TF抗原及其类似物。 0063 所述反应完成采用TLC（乙腈:水:醋酸=2:1:0.2 for compound 12 and 15;乙 酸乙酯:甲醇:水:醋酸=4:2:1:0.1

31、 for compound 13,14,16 and 17）检测。 0064 所述步骤（2）中连续一锅双酶法中先后用到的酶分别是E.coli K-12 galactokinase（GalK）和Bifidobacterium infantis D-galactosyl-1-3-N-acetyl-D- hexosamine phosphorylase（BiGalHexNAcP)，反应时间为25分钟-35小时。 0065 所述步骤（3）中一锅双酶法唾液酸化中用到的酶是Neisseria meningitidis CMP-sialic acid synthetase(NmCSS)和Pasteurell

32、a multocida sialyltransferase 1(PmST1)，反应时间为5分钟-30小时。 0066 所述步骤（2）和步骤（3）中一锅双酶法合成中反应温度为0-37，转速为 0-240rpm；所述酶反应的停止方法是向反应中加入与反应体系等体积的4无水乙醇并在 4下培育0-30分钟。 0067 通式或通式在制备抗肿瘤疫苗中的应用。由于氟代肿瘤相关糖抗原具有比天 然糖抗原更优越的药代性质，因而，本发明的在发展新型抗肿瘤疫苗具有广泛的应用前景。 0068 Thomsen-Friedenreich抗原，又名T-抗原，TF-抗原或CDl76，具体结构为 Gall-3GalNAcOR。唾液

33、酸化Thomsen-Friedenreich抗原，即sTF抗原，sT抗原。 0069 本发明提供了一种高效简捷的化学酶法合成TF抗原及其类似物的合成方法，本 发明将化学合成法的灵活性和酶合成法的高区域选择性和高效性结合到一起，首次实现了 氟代TF-抗原的酶法合成，解决了目前化学合成氟代TF抗原中所面临的底物反应活性低、 合成步骤繁多、收率低等不足。由于氟代肿瘤相关糖抗原具有比天然糖抗原更优越的药代 性质，因而，本发明的在发展新型抗肿瘤疫苗具有广泛的应用前景。 具体实施方式 说 明 书CN 102796144 A 6/13页 10 0070 1.化学酶法合成T抗原和sT抗原及其氟代衍生物 007

34、1 化合物2-乙酰氨基-2-脱氧-D-半乳糖的合成 0072 反应方程式如下： 0073 0074 向500mL圆底烧瓶中，加入半乳糖氨基盐酸盐(7.01g,32.51mmol)、醋酐(60mL)、 吡啶(Pyr 120mL)、二甲氨基吡啶(DMAP 1.06g,8.68mmol)，室温搅拌12h。薄层色谱检测 （石油醚:乙酸乙酯=3:2），反应完全后，向反应液中加入20mL甲苯，旋蒸浓缩，反复进行3 次。所得固体复溶于30mL甲醇，放置超声波0.25h后，在4条件下静置12h。过滤，弃除 滤液，收集所得固体，干燥，获得白色固体化合物18(10.75g,收率85%)。 0075 向500mL圆

35、底烧瓶中，加入固体化合物18(5.69g,14.85mmol)和干燥的甲醇 260mL，逐渐加入甲醇钠至反应夜pH值在9.0-10.0内。室温搅拌4小时，薄层色谱检测反 应完全后，逐渐加入酸性离子交换树脂Dowex 50W至中性。过滤，收集滤液进行蒸干，得到 化合物2-乙酰胺基-2-脱氧-D-半乳糖(GalNAc,2；2.79g,收率85%)。 0076 化合物3-叠氮丙基2-乙酰胺基-2-脱氧-D-吡喃半乳糖苷(GalNAc ProN3，3) 的合成 0077 反应方程式如下： 0078 0079 向250mL茄形瓶中，加入化合物18(5.06g,13.20mmol)、干燥的无水1,2-二氯

36、乙烷 (137mL)、无水硫酸钙(7.61g,55.91mmol)、三氯化铁(5.68g,35.05mmol)和3-氯-1-丙醇 (4.5mL,53.83mmol)，在剧烈的搅拌下回流16小时。薄层色谱检测（石油醚:乙酸乙酯=3:2） 反应完成后，使用硅藻土过滤，旋蒸浓缩，快速柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯=3:2)，得到 化合物19(3.92g,收率70%)。 0080 向250mL反应瓶中，加入化合物19(2.05g,4.84mmol)、DMF(70mL)、叠氮化钠 (2.03g,29.04mmol)、四丁基碘化铵(0.36g)，升温至110搅拌12h。薄层色谱检测反应 完全后，使用硅藻土过

37、滤，旋蒸浓缩，快速柱分离纯化获得白色固体化合物20(2.04g,收率 98%)。 0081 向250mL茄形瓶中，加入化合物20(2.04g,4.74mmol)、无水甲醇(85mL)，逐渐加入 甲醇钠至pH值在9.0-10.0范围，室温搅拌4小时。薄层色谱检测（石油醚:乙酸乙酯=3:2） 说 明 书CN 102796144 A 10 7/13页 11 反应完全后，逐渐加入酸性离子交换树脂Dowex 50W至中性。过滤收集滤液蒸干，得到化合 物3(1.42g,收率99%)。参数如下： 1 H NMR(600MHz,D 2 O)4.76(d,J=3.8Hz,1H),4.01(dd,J =7.8,3

38、.9Hz,1H),3.86-3.76(m,3H),3.69-3.58(m,3H),3.42-3.27(m,3H),1.90(s,3H),1.7 5(m,2H).LRMS(ESI)m/z calcd for C 11 H 21 N 5 O 6 (M+H + )304.15,found 305.40。 0082 化合物3-叠氮丙基2-乙酰胺基-2,6-二脱氧-6-氟-D-吡喃半乳糖苷 (GalNAc6FProN 3 ,4)的合成 0083 反应方程式如下： 0084 0085 向250mL茄形瓶中，加入化合物3(1.42g,4.69mmol)、2,2-二甲氧基丙烷(55mL)、 D(+)-10-樟

39、脑磺酸(CSA，0.15g,0.66mmol)，加热至110回流1.2h。加三乙胺淬灭 D(+)-10-樟脑磺酸中止反应，旋蒸浓缩至干，得糖稀状残留物。将其复溶于80%的甲醇 (22mL)，加热回流3h。旋蒸浓缩，快速柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯=2:1,2:3)，获得糖 稀状化合物21(1.58g,收率98%)。 0086 将化合物21(0.69g,2.00mmol)、二乙氨基三氟化硫(DAS T,0.51g,3.16mmol)、 2,4,6-三甲基吡啶(collidine,0.84g,6.93mmol)和干燥的1,2-二氯乙烷(DCE，5mL)加入 10mL微波反应管（MW）中，在80、1

40、00W的条件下反应1小时。冷却至室温后，加入甲醇终 止反应。旋蒸浓缩，快速柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯=3:2)，获得化合物22(0.56g,收 率81%)。 0087 将化合物22(0.74g,2.12mmol)在80%的醋酸(31.25mL)中加热至80反应4h。 薄层色谱检测反应完成后，旋蒸浓缩并用甲苯带三次(3x15mL)至干。经快速柱分离纯化， 获得白色粉末状化合物4(0.58g,收率90%)。参数如下： 1 H NMR(600MHz,D 2 O)4.96(d,J=3 .7Hz,1H),4.74(dt,J=3.6,10.2Hz,1H),4.65(ddd,J=4.2,10.8,30.0

41、Hz,1H),4.26(ddd,J=1 6.8,7.2,3.6,1H),4.21(dd,J=11.4,3.6Hz,1H),4.08(d,J=3.0Hz,1H),3.98(dd,J=11.4,3. 6Hz,1H),3.82(dt,J=10.2,6.0Hz,1H),3.57(dt,J=10.3,6.0Hz,1H),3.48(ddt,J=18.9,12. 5,6.2Hz,2H),2.07(s,3H),1.92(m,2H). 13 C NMR(151MHz,D 2 O)174.57,97.16,83.51(d,J= 165.19Hz),69.37(d,J=19.93Hz),68.13(d,J=7.85

42、Hz),67.31,65.14,49.82,48.11,27.90, 21.92. 19 F NMR(282MHz,D 2 O)-229.95。 0088 化合物6-脱氧-6-氟-D-半乳糖(Gal6F,5)的合成 0089 反应方程式如下： 0090 说 明 书CN 102796144 A 11 8/13页 12 0091 将半乳糖(1,10.82g,60.05mmol)溶于干燥的丙酮(380mL)，在冰浴条件下 逐渐加入浓硫酸(12.0mL)。移除冰浴，在室温下搅拌3.5h。加入水(11.0mL)和碳酸 钠(23g,217.00mmol)淬灭硫酸终止反应。使用硅藻土过滤，旋蒸浓缩，快速柱分

43、离纯 化(石油醚:乙酸乙酯=1:5,1:10)，获得糖稀状化合物23(15.16g,97%)。将化合物 23(0.71g,2.75mmol)、二乙氨基三氟化硫(DAS T,0.58g,3.60mmol)、2,4,6-三甲基吡啶 (collidine,0.80g,6.60mmol)和干燥的1,2-二氯乙烷(DCE,5mL)加入10mL微波反应管 中，在80、100W的条件下反应1小时。冷却至室温后，加入甲醇终止反应。旋蒸浓缩，快 速柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯=15:1)，得化合物24(0.81g,收率84%)。 0092 将化合物24(2.67g,10.17mmol)溶于80%醋酸(67mL)

44、加热回流24小时。薄层 色谱检测（乙酸乙酯：甲醇=10:1）反应完成后，旋蒸浓缩，快速柱分离纯化(乙酸乙酯： 甲醇=10:1)，获得白色固体化合物5(1.50g,收率81%)。参数如下： 1 H NMR(600MHz,D 2 O) 5.25(d,J=3.8Hz,1H),4.69-4.49(m,8H),4.30(ddd,J=16.5,7.4,3.6Hz,1H),4.00(s,1 H),3.95(ddd,J=14.4,6.9,3.3Hz,4H),3.81(ddd,J=35.9,10.3,3.6Hz,2H),3.63(dd,J=1 0.0,3.5Hz,2H),3.47(dd,J=9.9,8.0Hz,

45、1H). 13 C NMR(151MHz,D 2 O)96.32,92.25,83.39 (d,J=165.19Hz),83.03(d,J=165.65Hz),82.48,73.32(d,J=20.08Hz),72.42,71.58,68. 92(d,J=12.53Hz),68.83,68.74,68.73,68.26(d,J=7.55Hz),68.07. 19 F NMR(282MHz,D 2 O) -229.62,-229.76. 0093 2.一锅双酶法合成TF抗原及其氟代类似物 0094 一锅双酶法的一般操作方法： 0095 0096 一锅双酶法的一般操作方法 0097 受体(2,3

46、or 4,50-100mg)和半乳糖(1,)或6-氟代半乳糖(5)、ATP的摩尔比 为1:1.5:1.5（这里是比例，后面是具体值，二者不对等，建议统一成具体的摩尔范围值。下 同）、Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 7.5)和氯化镁(20mM)溶于50mL离心管中，加双蒸水至 总体积10mL后，加入第一个酶GalK(3.0-4.0mg)。将反应体系置摇床中37、140rpm培育 15小时。薄层色谱(乙腈:水:醋酸=2:1:0.2)检测反应完成后，用盐酸溶液调节pH值到 6.0左右，加入第二个酶(BiGalHexNAcP，2.0-3.0mg)，37、140rpm培育20-30小时。TLC

47、 说 明 书CN 102796144 A 12 9/13页 13 检测反（乙腈:水=10:1）应完全后，加入等体积的冷无水乙醇4、140rpm培育30min以终 止反应。将反应体系4、12000rpm离心21分钟，收集上清液。上清液过0.22m的微孔 滤膜后，浓缩。通过硅胶柱快速柱分离(乙腈:水=10:1)和Bio-gel P2凝胶分子排阻色 谱进行组合纯化，获得纯品Thomsen-Friedenreich抗原及其氟代类似物（收率80%-87%）。 0098 以下为一锅双酶法合成获得的代表性化合物6-11的列表： 0099 0100 合成的代表性TF-抗原 0101 以下为一锅双酶法合成获得的

48、化合物6-11的收率及结构信息： 0102 -D-吡喃半乳糖基-(13)-2-乙酰胺基-2-脱氧-D-半乳糖 (Gal1-3GalNAc,6,81%) 0103 1 H NMR(600MHz,D 2 O)5.21(s,0.6H),4.69(d,J=8.3Hz,0.4H),4.48(d,J=7.2Hz ,0.6H),4.44(d,J=7.2Hz,0.4H),4.29(d,J=10.8Hz,0.6H),4.25(s,0.6H),4.18(s,0.4H), 4.13(s,0.6H),4.03(d,J=10.8Hz,0.6H),4.00-3.55(m,8H),3.52(t,J=7.8Hz,1H),2.02( s,3H). 13 CNMR(151MHz,D 2 O)174.48,104.67,97.13,77.09,74.91,72.39,70.54,70.50,6 8.68,68.49,64.79,61.11,60.90,48.59,48.08,27.88,21.89.HRMS(ESI)m/z calcd for C 14 H 26 NO 11 (M+H + )384.1506,found 384.1502. 0104 3-叠氮丙基-D-吡喃半乳糖基-(13)-2-乙酰胺基-2-脱氧-D-吡喃半乳糖 苷(Gal1-3GalNAcaPro