用于RNAI试剂体内递送的新型组合物.pdf

1、10申请公布号CN102112110A43申请公布日20110629CN102112110ACN102112110A21申请号200980130361522申请日2009060561/059,62020080606US61/092,56920080828USA61K9/107200601A61K48/00200601A61P35/00200601A61K9/12720060171申请人米尔纳医疗股份有限公司地址美国德克萨斯州申请人BIOO科技公司72发明人兰斯福特戴维布朗安德烈亚斯G巴德74专利代理机构北京市柳沈律师事务所11105代理人闵丹54发明名称用于RNAI试剂体内递送的新型组合物57

2、摘要本专利申请描述了含有用于在活体内递送RNAI、抗MIRNA或核酸适体试剂的中性磷脂的乳剂。本专利申请还涉及制备所述制剂的方法以及将所述制剂作为递送试剂的使用。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2011013186PCT申请的申请数据PCT/US2009/0465052009060587PCT申请的公布数据WO2009/149418EN2009121051INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书23页附图17页CN102112114A1/2页21一种组合物，其包含脂质组分、含水组分和非离子表面活性剂的乳状液，其中所述脂质组分包含20重量至100重

3、量的中性磷脂和0至80重量的油脂或蜡；所述含水组分包含水性介质中的RNAI试剂；以及所述表面活性剂包含01重量至50重量的所述总乳状液。2根据权利要求1所述的组合物，其中所述中性磷脂为1，2二油酰SN甘油3磷酰胆碱。3根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述油脂为角鲨烯。4根据权利要求3所述的组合物，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯20。5根据权利要求3所述的组合物，其中所述RNAI试剂为MIRNA。6根据权利要求3所述的组合物，其中所述RNAI试剂为SIRNA。7根据权利要求1所述的组合物，进一步包含抗氧化剂。8根据权利要求1所述的组合物，其中所述脂质组分包含20重量至40重量的磷脂和60重量

4、至80重量的油脂或蜡；并且所述表面活性剂包含40重量至50重量的所述总乳状液。9一种制备乳状液的方法，包括以下步骤A在有机溶剂中混合中性磷脂、油脂和非离子表面活性剂；B蒸发所述有机溶剂以形成干燥的脂质组分；以及C将所述脂质组分与水性介质中的RNAI试剂混合；其中所述脂质组分包含20重量至100重量的中性磷脂和0至80重量的油脂或蜡；所述RNAI组分包含水性介质中的RNAI试剂；以及所述表面活性剂包含01重量至50重量的所述总乳状液。10根据权利要求9所述的方法，其中所述中性磷脂为1，2二油酰SN甘油3磷酰胆碱。11根据权利要求9或10所述的方法，其中所述油脂为角鲨烯。12根据权利要求11所述的

5、方法，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯20。13根据权利要求11所述的方法，其中所述RNAI试剂为MIRNA。14根据权利要求11所述的方法，其中所述RNAI试剂为SIRNA。15根据权利要求9所述的方法，其中所述脂质组分包含20重量至40重量的磷脂和60重量至80重量的油脂或蜡；并且所述表面活性剂包含40重量至50重量的所述总乳状液。16根据权利要求9所述的方法，其中所述蒸发采用冻干法来完成。17根据权利要求9所述的方法，其中所述步骤C中的混合采用声波降解法来完成。18根据权利要求9所述的方法，进一步包括挤压所述步骤C中形成的混合物。19根据权利要求9所述的方法，进一步包括将抗氧化剂添加至所述

6、步骤A中的混合物。20一种将RNAI试剂递送至动物的方法，包括将权利要求1所述的组合物施用给所述动物。21根据权利要求20所述的方法，其中所述组合物通过注射给药。22根据权利要求21所述的方法，其中所述组合物系统地施药。权利要求书CN102112110ACN102112114A2/2页323根据权利要求21所述的方法，其中所述RNAI试剂为MIRNA。24一种组合物，其包含脂质组分、含水组分和非离子表面活性剂的乳状液；其中所述脂质组分包含20重量至100重量的中性磷脂和0至80重量的油脂或蜡；所述含水组分包含水性介质中的抗MIRNA试剂；以及所述表面活性剂包含01重量至50重量的所述总乳状液。

7、25一种组合物，其包含脂质组分、含水组分和非离子表面活性剂的乳状液；其中所述脂质组分包含20重量至100重量的中性磷脂和0至80重量的油脂或蜡；所述含水组分包含水性介质中的核酸适体；以及所述表面活性剂包含01重量至50重量的所述总乳状液。权利要求书CN102112110ACN102112114A1/23页4用于RNAI试剂体内递送的新型组合物0001目前，人们正对将多种类型的核酸用作可能的疗法进行研究，诸如RNA干扰试剂、核酸适体、抗MIRNA或基因替代疗法。RNA干扰RNAI通常涉及主要在转录后水平上调节基因表达的细胞途径。科学家使用多种RNAI试剂和工具来进行功能基因组筛查、药物开发研究和

8、体内靶标确认，并且RNAI试剂能够在体外和体内检测中下调基因的表达。RNAI试剂的例子包括但不限于短干扰RNASIRNA、微RNAMIRNA、PIWI相互作用RNAPIRNA、核酶和反义化合物。多种RNAI试剂通过共同的途径起作用，并且通常导致一个或多个靶标MRNA分子裂解、翻译减少或其它表达干扰图1。0002微RNAMIRNA是一种内源性非编码小分子RNA，其通过结合至靶标MRNA转录本和1引发转录本降解或2更改来自转录本的蛋白翻译来调节基因表达。MIRNA经常在癌组织和其它病变组织中有区别地表达，并且当解除调节时会导致各种人类疾病包括癌症的发生。抗MIRNA是通过杂交来干扰靶标MIRNA活

9、性的短核酸。抗MIRNA的使用致使受靶标MIRNA调节的MRNA的活性增加，而不是减少靶标MRNA的表达或活性。0003RNAI试剂能够从细胞内开始进入RNAI途径，或能够被递送至细胞内。尽管RNAI试剂是作为基因特效药而进行研发的，但是该技术未来的成功是与递送化学物质、方法和制剂的发展密切联系在一起的，所述化学物质、方法和制剂将RNAI试剂递送至植物和动物活体内的细胞和器官，无毒且高效。0004核酸适体是特异地结合至诸如蛋白质的分子靶标的小核酸分子。与通过杂交至另一核酸靶标进行作用的核酸治疗剂不同，核酸适体形成三维形状从而使得其可特异结合至酶、生长因子、受体、病毒蛋白和免疫球蛋白。0005对

10、于基于寡核苷酸的试剂来说，有效的递送至靶标器官和与该等递送相关的高成本是治疗剂应用面临的主要限制条件之一。例如，目前在平均大小的小鼠中每次注射所用的SIRNA量的范围是单位剂量从003MG至24MG150MG/KG。人平均体重约80KG且按比例将需要约008G至40G的SIRNA。目前，008G的研究级SIRNA的价格超过3000美元。在将药物监管批准和药物检测要求的成本考虑进去后，用于制药的核酸成本将大幅增加。其它反义化合物和基于寡核苷酸的药物也面临着同样的问题。因此，例如，增加摄取进靶标细胞的效率或提高RNAI制剂的稳定性将降低治疗所需的RNAI试剂的量，同时也降低了成本并减小了有害副作用

11、的可能。人们需要改善的RNAI试剂组合物以治疗疾病并且还需要制备该等组合物的方法。0006由阳离子磷脂制成的脂质体和乳状液已在之前用于小分子和核酸的递送和转染。在这些制剂中，阳离子脂质和带负电的核酸通过静电相互作用形成复合物。然而，这些制剂常常具有毒性特征使其不适合体内应用。请参阅，如CAMPBELLPI，CYTOBIOS，371452161983；SENIORJH等人，BIOCHIMBIOPHYSACTA，1070117391991；FILIONMC等人，BIOCHIMBIOPHYSACTA，13292345561997。0007本发明涉及RNAI试剂、抗MIRNA或核酸适体的亲脂性制剂。该

12、制剂可被称为磷脂油脂RNAI乳状液PORE，其含有中性磷脂、油脂和RNAI试剂图2。在一些实施例中，该制剂包括用于RNAI试剂、抗MIRNA或核酸适体递送的非离子表面活性剂、脂质组分和说明书CN102112110ACN102112114A2/23页5含水组分。本文还描述了制备该等制剂和使用该制剂用于治疗之目的的方法。这些方法具有促进RNAI试剂的治疗应用和提高RNAI试剂体内递送图3能力的功用。0008在一些实施例中，乳剂包含中性磷脂、油脂和非离子表面活性剂。在其它实施例中，在制剂中使用不止一种中性磷脂。在其它实施例中，在制剂中使用不止一种油脂。在某些实施例中，中性磷脂为1，2二油酰SN甘油3

13、磷酰胆碱DOPC。在一些实施例中，油脂为角鲨烯。在其它实施例中，聚山梨醇酯20TWEEN20或聚山梨醇酯80TWEEN80是非离子表面活性剂。在某些实施例中，RNAI试剂为MIRNA或SIRNA。乳剂可以包括其它组分，诸如抗氧化剂、蜡、清洁剂或它们的组合。某些实施例包括制备乳剂的方法。在一些实施例中，制备脂质组分而后与含水组分混合以形成乳状液。0009乳剂可以用于将至少一种RNAI试剂、抗MIRNA试剂或核酸适体递送至活体动物的组织。在某些实施例中，乳剂保护RNAI试剂在循环系统中免于降解。此外，乳剂能够促进RNAI试剂穿过诸如细胞膜的生理屏障的传递。0010在一个实施例中，治疗哺乳动物疾病或

14、调节细胞中靶标核酸表达的方法包括以缓解疾病的某些症状或改变细胞中靶标核酸水平的有效剂量，给哺乳动物受试者施用含有RNAI试剂、抗MIRNA或核酸适体的制剂。在一些实施例中，组合物和方法可以用于治疗以一个或一组基因的表达或过表达为特征的疾病和病症，诸如癌症、代谢性疾病、传染性疾病和免疫失调等等，除了别的以外。0011本发明的其它实施例在整个本专利申请中进行讨论。本发明的其它目的、特征和优点通过下文的具体实施方式将变得显而易见。就本发明的一个方面所讨论的任何实施例也适用于本发明的其它方面，反之亦然。在实例部分的实施例应理解为适用于本发明所有方面的本发明实施例。0012然而，应当理解，表示本发明的特

15、定实施例的具体实施方式和特定实例，仅以示例的方式给出，原因是根据本具体实施方式，在本发明的精神和范围内的各种变更和修改对那些本领域的技术人员而言将是显而易见的。0013本发明的其它方面在以下的描述中进行阐明。0014附图简述0015图1示出在转录后水平上用于形成RNAI的细胞途径以及用于沉默基因表达的RNAI介导的机理。0016图2示出微观层次的磷脂油脂RNAI乳状液PORE。0017图3示出用于制备PORE的方法及其在活体内的使用。0018图4示出注射含有GAPDHSIRNA的PORE的小鼠器官内的相对GAPDH蛋白水平。将GAPDH的相对水平与使用阴性对照SIRNA治疗的小鼠作比较。001

16、9图5示出注射含有GAPDHSIRNA的PORE的大鼠器官内的相对GAPDH蛋白水平。将GAPDH的相对水平与使用阴性对照SIRNA治疗的大鼠作比较。0020图6示出在小鼠已注射含有GAPDHSIRNA的PORE之后，通过免疫组织化学和ELISA所估测的小鼠心脏内的相对GAPDH蛋白水平。将GAPDH的相对水平与使用阴性对照SIRNA治疗的小鼠作比较。0021图7A示出未感染的小鼠或用PORE配制的RSVSIRNA治疗的、无任何制剂裸SIRNA治疗的、或无任何SIRNA治疗的呼吸道合胞病毒RSV感染的小鼠的呼说明书CN102112110ACN102112114A3/23页6吸频率。图7B示出用

17、PORE配制的RSVSIRNA治疗的、无任何制剂裸SIRNA治疗的、或无任何SIRNA治疗的小鼠的病理评分。图7C是示出测试4天后用PORE配制的或无制剂裸SIRNA治疗的小鼠的RSV滴定度的图。0022图8是示出通过向含有中性脂质的制剂添加角鲨烯而获得基因减少改善的图。0023图9示出将PORE配制的荧光素酶特异的SIRNA系统递送至小鼠内原位肺癌移植瘤的结果。携带人H460非小细胞肺癌移植瘤其稳定地表示肺内的荧光素酶及生长情况的小鼠，以1毫克每千克小鼠体重1MG/KG的最终浓度接受PORE配制的荧光素酶SIRNASILUC图9B，动物3和4或PORE配制的阴性对照NC寡核苷酸图9A，动物1

18、和2的静脉注射。示出活性荧光素酶的荧光信号的图像取自临制剂注射之前0时和注射后48时。0024图10示出用PORE配制的荧光素酶SIRNA治疗的原位肺肿瘤内的荧光素酶活性。示出了采自图9中动物的数据的定量。在0时的总通量设定为100的荧光素酶活性。注射后48时的荧光素酶的活性百分比示出在图中。0025图11示出PORE配制的治疗MIRNA的瘤内递送。携带可触摸的皮下H460非小细胞肺癌移植瘤的小鼠用含有HSAMIR34A图11A，白色方格、HSAMIR124A图11B，白色菱形的PORE或阴性对照MIRNA图11A和11B，MIRNC，黑色圆圈进行治疗。单独一组荷瘤动物仅使用磷酸盐缓冲盐水PB

19、S或磷脂油脂乳状液在图11A和11B中分别为黑色菱形和黑色方格进行治疗。在移植瘤移植后的第12、15和18天箭头瘤内注射IT制剂。图中示出了7只动物MIR34A、MIR124、MIRNC或4只动物仅PBS、磷脂油脂的平均和标准偏差。0026图12示出PORE配制的治疗MIRNA的系统递送的结果。携带可触摸的皮下H460非小细胞肺癌移植瘤的小鼠用含有HSAMIR34A图12A，白色方格、HSAMIR124A图12B，白色菱形的PORE或阴性对照MIRNA图12A和12B，MIRNC，黑色圆圈进行系统地治疗。单独一组荷瘤动物仅用磷脂油脂乳状液图12A和12B，黑色方格进行治疗。在移植瘤移植后的第1

20、2、15和18天箭头将制剂通过尾静脉注射IV进行给药。图中示出了每组中4只动物的平均和标准偏差。0027图13示出PORE配制的治疗MIRNA各种剂量的系统递送的结果。确诊有皮下人H460非小细胞肺癌移植瘤的小鼠用PORE配制的HSAMIR34A寡核苷酸进行静脉注射。图中示出使用的剂量和治疗的天数。作为对照，给单独一组荷瘤动物注射磷酸缓冲盐水。图中示出了每组中3只动物的平均和标准偏差。将数据绘成总肿瘤体积图13A或是相对于第一次治疗天数的肿瘤生长百分比图13B，第12天，100。0028图14示出PORE配制的治疗MIRNA向小鼠内原位生长肺肿瘤的系统递送。携带原位肺癌移植瘤的小鼠通过在第39

21、天至第52天之间每2天一次的系统给药来接受PORE配制的HSAMIR124A。作为正常肿瘤生长的参考，还使用了未经治疗的小鼠。数据如整个小鼠的图像图14A或以总通量单位表示的定量图14B所示。具体实施方式0029在某些方面，乳剂含有用于将RNAI试剂递送至细胞的中性磷脂和油脂。在某些说明书CN102112110ACN102112114A4/23页7方面，乳剂含有用于将RNAI试剂递送至细胞的聚山梨醇酯和中性磷脂。在一些方面，使用RNAI制剂来治疗动物或人类的疾病。还包括制备和使用该RNAI制剂的方法。0030为帮助理解本发明，首先对某些术语进行了定义。在整个专利申请中还提供了其它定义。0031

22、术语“RNAI试剂”包括短干扰RNASIRNA、微RNAMIRNA、与PIWI相互作用RNAPIRNA、核酶和反义化合物。RNAI试剂包括含有RNA、DNA或两者的核酸。在一些实施例中，RNAI试剂的长度不到200个核苷酸。在其它实施例中，RNAI试剂的长度不到50个核苷酸。在某些实施例中，RNAI试剂的长度约15至约25个核苷酸。在一些实施例中，RNAI试剂是双链的，而其它实施例包括单链的RNAI试剂。RNAI试剂可进行化学改性。0032如本文所用，术语“SIRNA”是指长度约15至约25个核苷酸的双链RNA。SIRNA可以具有平端，或可以在一端或两端具有单链悬突。此外，SIRNA可以包括化

23、学改性，诸如主链、糖、碱基或末端3或5端改性。SIRNA可含有完全或部分与一个或多个靶标MRNA互补的序列。0033如本文所用，术语“微RNA”MIRNA包括可以是天然存在的或合成产生的人MIRNA、成熟单链MIRNA、前体MIRNA以及它们的变体。在某些情况下，术语“MIRNA”还包括初级MIRNA转录本和复式MIRNA。当修饰MIRNA或诸如MIR13的特定MIRNA时，术语“成熟”是指从存在于生物样本内的对应的前体MIRNA序列加工的一个或多个成熟序列。当与特定MIRNA一起使用时如，HSAMIR34A，前缀“HSA”是指人MIRNA序列。包括人成熟序列和前体序列的某些MIRNA序列报告

24、在MIRBASESEQUENCESDATABASE中HTTP/MICRORNASANGERACUK；GRIFFITHSJONES等人，NUCLEICACIDSRESEARCH，2008，36，DATABASEISSUE，D154D158；GRIFFITHSJONES等人，NUCLEICACIDSRESEARCH，2006，34，DATABASEISSUE，D140D144；GRIFFITHSJONES，NUCLEICACIDSRESEARCH，2004，32，DATABASEISSUE，D109D111。熟练的技术人员将会知道，有关对于给定MIRNA、尤其是对于成熟形式的MIRNA的精确核酸序

25、列的科学共识，可随着时间的变化而变化。0034如本文所用“乳状液”是指悬浮于水溶液中不溶解的小脂滴。该脂滴可含有油脂、磷脂、表面活性剂或它们的混合物。0035在权利要求书和/或说明书中所用词“一个”、“一种”或“所述”，当与术语“含有”一起使用时，可以是指“一个”，但也可以是指“一个或多个”、“至少一个”和“一个或一个以上”。0036I乳剂0037在某些实施例中，包括脂质组分、含水组分和非离子表面活性剂的乳状液可用来将RNAI试剂递送至活体动物的组织。在一些实施例中，乳状液中脂滴的平均直径在50NM至2,000NM之间。在其它实施例中，平均直径在50NM至100NM、100NM至150NM、1

26、50NM至200NM、200NM至300NM、300NM至400NM、400NM至500NM、500NM至600NM、100NM至500NM、100NM至1000NM、500NM至1000NM或1000NM至2000NM之间。本领域的技术人员将会理解，乳状液制剂包含具有一定大小范围的脂质微粒。在一些实施例中，乳状液制剂包含与平均粒径相差10、15、20或25的脂质微粒。在一些实施例中，脂滴以较大的脂质球的形式而存在。在某些实施例中，脂质球具有从约10M至约1000M的直径。本领域的技术人员应认识到，不同的组织可能需要不同的递送粒径。例如，不同组织或肿瘤中脉管系统的说明书CN102112110A

27、CN102112114A5/23页8特性会影响最佳的递送粒径。0038A脂质组分0039制剂的脂质组分包含中性磷脂。在一些实施例中，脂质组分还包含油脂或蜡。脂质组分可包含20重量至100重量的中性磷脂和0至80重量的油脂或蜡。在含有油脂或蜡的制剂中，在该制剂中中性磷脂与油脂或蜡的重量比可以从12至16。在一些实施例中，磷脂与油脂的比为约12、13、14、15或16。00401磷脂0041磷脂最常见地是由结合至两个脂肪酸的甘油分子和磷酸基团所构成的双极性分子。在一些磷脂中，磷酸基团结合至另一化学基团，被称为头部基团。如果磷脂的净电荷为零，则其为中性磷脂。带有净正电荷的磷脂为阳离子磷脂，而带有净负

28、电荷的那些为阴离子磷脂。0042在一些实施例中，磷脂是中性磷脂。中性磷脂包括但不限于磷脂酰胆碱PC、1，2二油酰SN甘油3磷酰胆碱DOPC、卵磷脂、磷酸酰乙醇胺PE、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺IYSOPHOSPHATIDYLETHANOLAMINE、鞘磷脂SPHINOGOMYELINSM、心磷脂、磷脂酸PHOSPHOSPHATIDICACID、1，2二硬脂酰SN甘油3磷酰胆碱DSPC、1，2二棕榈酰SN甘油3磷酸乙醇胺DPPE、1棕榈酰2油酰SN甘油3磷酰胆碱POPC、1，2二月桂酰SN甘油3磷酸胆碱DLPC、1，2二肉豆蔻酰SN甘油3磷酸胆碱DMPC、1，2二棕榈酰SN甘油3磷酸胆碱DPP

29、C、1，2二肉豆蔻酰SN甘油3磷酸乙醇胺DMPE、1，2二油酰SN甘油3磷酸乙醇胺DOPE、二棕榈油酰DIPALMITOLOEOYLPE、二植烷醇DIPHYTANOYLPE、DSPE、二反油酸PE、二亚油酰SM和二亚油酰PE。在一些实施例中，中性磷脂DOPC和/或中性磷脂DOPE使用于乳剂中。00432油脂和蜡0044如本文所使用的“油脂”是指一组异质性的中性、可燃物质，其在室温下为液体，并且特有地可溶于相对非极性溶剂但仅微溶于含水溶剂。主要有三种类型1动物和植物油脂，其主要包括三酰基甘油，但也可包括不同量的其它醇的脂肪酸酯；2衍生自石油、煤、页岩的矿物油，其包括烃；和3精油。0045油脂的实

30、例包括但不限于植物油、棉籽油、油菜籽油、橄榄油、矿物油、甜杏仁油、蓖麻油、椰子油、棕榈油、大麻籽油、亚麻油、鱼油、鲸脂衍生油、鲨鱼肝油、角鲨烯或角鲨烯蜡。在其它实施例中，油脂可以包括油性脂肪醇、山梨醇酯和脂肪酸酯、中链甘油三酯、油性蔗糖酯或衍生自任何植物或动物源的油脂。在一些实施例中，油脂可以是离子或非离子嵌段共聚物、苯乙烯、二乙烯基苯、丙烯酸丁酯、丙烯酸2乙基己酯、丙烯酸环己酯、丙烯酸癸酯、丙烯酸月桂酯、丙烯酸十二碳烯醇酯、丙烯酸十四烷基酯、丙烯酸十六烷基酯、丙烯酸十六碳烯醇酯、丙烯酸十八烷基酯、丙烯酸十八碳烯醇酯、丙烯酸二十二烷基酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸2乙基己酯、甲基丙烯酸环己酯、

31、甲基丙烯酸癸酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸十二碳烯醇酯、甲基丙烯酸十四烷基酯、甲基丙烯酸十六烷基酯、甲基丙烯酸十六碳烯醇酯、甲基丙烯酸十八烷基酯STRARYLMETHACRYLATE、甲基丙烯酸十八碳烯醇酯ACTADECENYLMETHACRYLATE或甲基丙烯酸二十二烷基酯。在一些实施例中，角鲨烯可以用于形成乳剂。0046在某些实施例中，所述制剂含有蜡，所述蜡替代油脂或加成至油脂。本文所用的说明书CN102112110ACN102112114A6/23页9“蜡”是指活体有机体或原油的任何脂质部分或长链一羟基醇的任何脂肪酸酯，所述脂质部分是可塑性物质，冷却时变硬，加热时易于模制，且不溶于水。

32、0047蜡的实例包括但不限于蜂蜡、STEDMANS蜡、白蜡、紫胶蜡、鲸蜡、羊毛脂蜡、耳蜡、蜡果杨梅蜡、小烛树蜡、蓖麻蜡、EAPATRO蜡、日本蜡、霍霍巴蜡、小冠巴西棕榈蜡、米糠蜡、纯地蜡、褐煤蜡、纯地蜡、泥煤蜡、石蜡、微晶蜡、聚乙烯蜡、费托蜡FISHERTROPSCHWAX、化学改性蜡、酰胺替代蜡或聚烯烃或它们的组合。0048B含水组分0049乳剂的含水组分包含存在于水性介质中的RNAI试剂、抗MIRNA试剂或核酸适体。含水组分可以是任何药用的溶液或缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水PBS、盐水、林格氏溶液或水。缓冲含水组分可包括已知的缓冲剂和缓冲系统。在某些实施例中，RNAI或抗MIRNA试剂以约0

33、1MG/ML至约02MG/ML的浓度存在于水溶液中。0050RNAI试剂包括但不限于短干扰RNASIRNA、微RNAMIRNA、与PIWI相互作用RNAPIRNA、核酶和反义化合物。在一些实施例中，RNAI试剂为SIRNA或MIRNA。在一些实施例中，RNAI试剂通过质粒或其它表达载体进行表达。在其它情况下，RNAI试剂制备为PCR产物。RNAI试剂可以是单链的或双链的，并且一些RNAI试剂包括发夹或其它次生结构。一些RNAI试剂包括化学改性的RNA或DNA，诸如主链、糖、碱基、末端3或5端改性。RNAI试剂可包括抗癌剂、抗病毒剂、抗菌剂、免疫调节剂、抗寄生虫剂以及调节炎症、代谢或可与疾病或感

34、染有关的其它途径的试剂。0051在一些实施例中，脂质组分与RNAI试剂的重量比为约101、201、301、401、501或1001。在其它实施例中，脂质组分与含水组分的重量比为在11和11000之间。在某些实施例中，脂质与含水的重量比为约11、15、110、120、150、1100、1500或11000。0052C非离子表面活性剂0053在一些实施例中，乳剂含有非离子表面活性剂。非离子表面活性剂的例子包括但不限于聚山梨醇酯20TWEEN20、聚山梨醇酯80TWEEN80、诺乃洗涤剂P40NP40、CHAPS或它们的组合。非离子表面活性剂的其它的例子包括TRITONX100、TRITONX114

35、、NP40、BRIJ35、BRIJ58、辛基葡糖苷和辛硫基葡糖苷。在一些实施例中，表面活性剂TWEEN20可用于形成乳剂。0054在某些实施例中，非离子表面活性剂占总制剂的001重量至50重量之间。在一些实施例中，表面活性剂占总乳剂按重量计约001、01、1、5、10、20、30、40或50。在某些实施例中，表面活性剂占总乳剂按重量计约01至5、1至10、2至20、10至33、20至40、20至33、30至50、30至40或40至50。在其它实施例中，表面活性剂与脂质组分的比在110,000和13,000、13,000和11,000、11,000和1300、1300和1100、1100和110

36、、130和110、130和11、11和31、11和101、11和151、151和301或151和501之间。0055D其它组分0056在一些实施例中，乳剂含有抗氧化剂。抗氧化剂的例子包括但不限于抗坏血酸、生育酚、白藜芦醇、类黄酮、番茄红素、胡萝卜素L半胱氨酸和鼠尾草酚。在一些实施例中，抗说明书CN102112110ACN102112114A7/23页10坏血酸可用于乳剂。在某些实施例中，抗氧化剂以约001MG/ML至10MG/ML的浓度存在于乳状液中。在一些实施例中，乳状液含有约011MG/ML、12MG/ML、15MG/ML、110MG/ML或510MG/ML浓度的抗氧化剂。0057在另一实

37、施例中，磷脂共轭至抗体或其它靶向剂，从而能够将RNAI试剂定向递送至特异靶标器官。抗体识别组织特异的靶标，从而集中递送至那些组织。其它靶向剂包括蛋白质、碳水化合物或用于组织或细胞特异的受体、病毒载体以及本领域已知的其它靶向部分的小分子配体。0058II制备方法0059在一些实施例中，脂质组分通过将中性磷脂和油脂与有机溶剂如，氯仿、己烷混合进行制备。使用本领域已知的标准干燥或蒸发法，将有机溶剂从所得的混合物中移除。在一些实施例中，在干燥或蒸发步骤之前脂质组分在80下进行冷冻。在干燥或蒸发步骤之前混合物可以冷冻至少10分钟、20分钟或30分钟。在某些实施例中，干燥或蒸发包括冻干法或旋转蒸发。所得的

38、物质也可以通过在其上穿过惰性气流如，氮气进行干燥。0060在一些实施例中，将非离子表面活性剂添加至脂质混合物并与脂质一起干燥。在形成乳状液之前，也可将表面活性剂添加至含水组分，或可将其添加至脂质含水混合物。在一些实施例中，含水组分包含约01MG/ML至20MG/ML之间的RNAI、抗MIRNA或核酸适体试剂。在某些实施例中，至少使用5L的脂质组分来配制100G的RNAI、抗MIRNA或核酸适体试剂。在其它实施例中，脂质含水乳状液的体积在约1L和1ML之间。0061在某些实施例中，脂质组分与RNAI、抗MIRNA或核酸适体试剂在水溶液中结合并混合以形成乳状液。该乳状液可以通过在水溶液中高能量混合

39、脂质、油脂、表面活性剂和核酸来制备。合适的高能混合方法包括声波降解法、挤压、均化、加压、加热、冷冻、破碎、激光照射、搅拌，用其它高能运动或其它本领域的技术人员已知的方法进行处理。在一些实施例中，声波降解法至少进行5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟或30分钟。在其它采用挤压法的实施例中，挤压膜的孔径可以小于50NM、100NM、150NM、200NM或400NM。可以通过依据粒径，例如，依据粒径、密度或场流分级法或色谱法析出微粒对乳状液进行进一步加工。0062乳剂可以包括脂质体以及其它脂质载体微粒，所述脂质体为含有具有脂双层的囊泡的脂质，所述脂质载体微粒能够捕集核酸试剂。脂质体能够由

40、中性磷脂制成。合适的磷脂包括DOPC、DOPE和本文列出的其它磷脂。脂质体可以是单层、多层或具有不定的层状结构。在一些方面，脂质体捕集、封装和/或结合核酸试剂，从而使得所述试剂装入脂质体的一些部分或与其结合。在一些实施例中，脂质微粒形成胶束。胶束可以具有由中性磷脂包围的油脂核。在其它实施例中，脂质微粒可以反胶束的形式存在。核酸可包含在脂质微粒内、表面上和/或水相乳状液中。0063在某些实施例中，脂质组分和含水组分以约11至约11000的重量比进行结合。脂质组分和含水组分的比可以是约11、15、150、1100、1500或11000。比例的范围也包括在本范围内，诸如具有包括所列出值及其之间的比例

41、的各个子范围。乳剂中核酸的总浓度可以为从约01G/ML至约10MG/ML。在一些实施例中，核酸的浓度为约011MG/ML、012MG/ML、051MG/ML、12MG/ML、15MG/ML或110MG/ML。0064在一些实施例中，至少50、60、70、80或90的核酸与脂质微粒结合。所说明书CN102112110ACN102112114A8/23页11述制剂可以使用本领域已知的方法进行描述。0065III乳剂的使用0066乳剂用于多种应用，其包括治疗和研究之目的。该制剂适用于脊椎动物，诸如母牛、马、猪、猴、兔、大鼠、小鼠和人类。在其它实施例中，该制剂可用于将RNAI、抗MIRNA或核酸适体试

42、剂递送至其它动物，诸如鱼、青蛙、虾、用作食物或用作饲料的动物和植物、虫子包括但不限于蚂蚁、蜜蜂、苍蝇、蚊子、蚋、爬虫、飞虫、蠕虫或穴居虫。在其它实施例中，可将制剂施用于草、农作物、野生花草树木。0067疾病和病理状态包括但不限于增生性疾病、炎症性疾病、免疫性疾病、代谢疾病、传染性疾病和缺血性疾病。疾病还包括神经系统、免疫系统、肌肉、生殖、胃肠道、肺、心血管、肾、增生和/或癌症疾病、失调和病症。本领域的技术人员将会理解，沉默或减少与疾病或病症相关的基因表达能够与其它常规疗法相结合。0068示例性的癌症包括恶性血液病、白血病包括急性白血病例如，急性淋巴细胞白血病，包括原粒细胞、早幼粒细胞、粒单核细

43、胞、单核细胞的急性髓细胞白血病和红白血病和慢性白血病例如，慢性髓细胞粒细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生异常综合征真性红细胞增多症、淋巴瘤例如，霍奇金病和非霍奇金病、多发性骨髓瘤、WALDENSTROM巨球蛋白血症、重链病和实体瘤，所述实体瘤包括但不限于肉瘤和癌，诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状上皮细胞癌、基底细胞癌、腺癌、腺体癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、

44、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、甲状腺癌或肉瘤、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、皮肤癌包括，如上皮癌、肉瘤和黑素瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤MENANGIOMA、黑素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤；和/或癌转移，包括在骨、肝脏和肺内的转移。0069根据本领域的技术人员已知的任何药物施用的方法，可递送并使用最终物质，所述药物施用包括但不限于循环系统、皮肤、眼睛、耳朵、鼻子、咽喉、肛门、阴道和尿道。可能的给药方法包括静脉注射IV、皮下注射SUBQ、低压尾静脉注射LP

45、TV、高压尾静脉注射HPTV、吞服、腹腔注射IP、吸入、滴鼻、鞘内注射、瘤内注射、经皮给药、肌内注射、眼球内注射或耳蜗内灌注或它们的组合。例如，PORE制剂能够系统地或局部地递送至特异的组织或瘤。本领域的技术人员应认识到，哪种给药方法是适当的要取决于正在治疗的疾病或正施用的试剂类型。0070在一个实施例中，用作乳剂的组合物可包装在试剂盒内。例如，含有中性磷脂、油脂和非离子表面活性剂的组合物可包装在小瓶内。在一些实施例中，组合物包含在第一小瓶中的中性磷脂和油脂以及在第二小瓶中的非离子表面活性剂。试剂盒可包括干燥形式的RNAI、抗MIRNA或核酸适体试剂，其中所述试剂可适于注射并不含RNASE。在

46、替代实施例中，表面活性剂可与核酸试剂混合。试剂盒还可包括能够重新构成干燥形式的RNAI试剂的缓冲液组合物。试剂盒还可包括用于在与组合物混合后递送治疗剂的递送装置如，注射器。说明书CN102112110ACN102112114A9/23页120071IV实例0072以下实例示出了本发明的各个实施例，但并非旨在限制本发明的范围。0073实例1磷脂油脂RNAI乳状液PORE的制备和显微镜检查0074SIRNA和MIRNA试剂购自QIAGEN、SIGMA、IDT或APPLIEDBIOSYSTEMS。磷脂购自SIGMACHEMICAL或AVANTILIPIDS。角鲨烯购自SIGMA。0075100G抗坏

47、血酸、3L角鲨烯油脂、1MG2二油酰SN甘油3磷酰胆碱DOPC中性磷脂、49LTWEEN20和1ML氯仿的组合物在含有耐溶剂螺旋瓶盖的10ML玻璃小瓶中通过涡旋30秒进行混合。角鲨烯与DOPC的摩尔比率约为2001。混合物在80下培养至少10分钟。使用旋转蒸发器将氯仿在40下冻干，并且将混合物恢复至80保持至少20分钟。冻干的组合物进一步通过在其上通过氮气流使用稳定气流采用直接吹氮法进行干燥。所得的组合物非常粘稠，类似于重油，并使用TJ6离心机BECKMAN；FULLERTON，CA，USA以5,000RPM的速度旋转离心，从而使得试剂积聚在小瓶的底部。0076将溶解在150LPBS中的100

48、GMIRNA样本直接添加至冻干的磷脂油脂混合物，并使用G112SP1超声清洗器LABORATORYSUPPLIESCOMPANY，NEWYORK，USA以80KHZ和80瓦特在室温下进行声波处理10分钟。角鲨烯与MIRNA的摩尔比率约为11。控制超声清洗器的水温。如果温度上升超过40，则向水中加冰来降低温度。所得的物质是磷脂油脂RNAI乳状液PORE。0077PORE用显微镜放大100倍进行分析。在多种情况下，发现溶液中存在较大的结构。这些较大的脂质/油脂结构内部包含脂质体。在一些情况下，该结构表现为围绕着许多较小脂质体01M至10M的大油滴100M至1000M的混合物。RNAI试剂很可能通过

49、不止一个囊泡囊泡内的囊泡捕集和封装。这种独特的试剂混合物可以保护RNAI试剂免受体内核酸酶的影响，并且赋予其更长的循环寿命。0078实例2使用以中性磷脂配制的SIRNA的小鼠体内GAPDH的减少0079将100GGAPDHSIRNA在200LPBS中的溶液添加至根据实例1方法制备的100G抗坏血酸、3L角鲨烯、1MGDOPC和49LTWEEN20的冻干磷脂油脂混合物。该混合物使用112SP1特殊超声清洗器LABORATORYSUPPLIESCOMPANY，NEWYORK以80KHZ和80瓦特进行声波处理5分钟以制备PORE。将该PORE注射至小鼠的尾静脉。注射后72时，处死动物，移除器官，使用GAPDHELISA试剂盒BIOOSCIENTIFIC，产品编号3401中提供的蛋白质提取缓冲液提取蛋白质，并采用BRADFORD测定法BIOOSCIENTIFIC，产品编号344001对蛋白质进行归一化。使用GAPDHELISABIOOSCIENTIFIC，产品编号340