一种超声辅助酶解去糖基化制备低致敏大豆7S蛋白的方法.pdf

1、10申请公布号CN104164464A43申请公布日20141126CN104164464A21申请号201410421064922申请日20140826C12P21/0020060171申请人南昌大学地址330031江西省南昌市红谷滩新区学府大道999号72发明人杨安树祖琴琴陈红兵吴志华李欣佟平龚育清范膑74专利代理机构南昌新天下专利商标代理有限公司36115代理人施秀瑾54发明名称一种超声辅助酶解去糖基化制备低致敏大豆7S蛋白的方法57摘要一种超声辅助酶解去糖基化制备低致敏大豆7S蛋白的方法，属于食品生物技术领域。本发明首先以大豆为原料，经脱脂、提取大豆7S蛋白、超声处理，然后向其添加十二

2、烷基磺酸钠、巯基乙醇等变性剂将蛋白进行改性处理，再加入一定酶活的糖苷酶在一定条件下进行去糖基化处理，离心取上清液，最后经冷冻干燥得到低致敏大豆7S蛋白粉。本发明提供了一种降低大豆7S蛋白过敏原致敏性的新方法，其工艺简单、条件温和、易于控制；产品致敏性低，营养价值高，特别适用于大豆过敏患者的消费需求，具有良好的推广和应用前景，可用于低致敏食物的生产和加工过程中。51INTCL权利要求书1页说明书4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页10申请公布号CN104164464ACN104164464A1/1页21一种超声辅助酶解去糖基化制备低致敏大豆7S蛋白的方法，

3、其特征是按以下步骤（1）称取一定质量的新鲜干大豆，研磨成粉末，脱脂风干，按照常规方法提取大豆7S蛋白；（2）将步骤（1）中所提取的大豆7S蛋白在水浴超声装置中超声处理，超声功率为300500W，时间为60MIN，然后向大豆7S蛋白溶液中加入005（KG/L）十二烷基磺酸钠、01（KG/L）巯基乙醇，在100加热10MIN，将蛋白浓度稀释至1G/L，加入糖苷酶，酶解温度37，酶添加量2001000U/MG蛋白，震荡速度300RPM，时间2436H，期间保持反应体系相对稳定，反应结束后在100灭酶10MIN，快速冷却反应液；（3）将步骤（2）中所得的酶解液在80预冻12H，然后在冷冻温度为65、真

4、空度100PA、加热板温度50条件下，真空冷冻干燥，至水分含量5，所得粉末即为低致敏大豆7S蛋白；步骤（2）所述的糖苷酶为肽N糖苷酶F、内切糖苷酶H、内切乙酰葡萄糖胺苷酶或糖肽酶A中的任意一种。权利要求书CN104164464A1/4页3一种超声辅助酶解去糖基化制备低致敏大豆7S蛋白的方法技术领域0001本发明属于食品生物技术领域。背景技术0002大豆含有蛋白质、异黄酮、低聚糖、皂苷及磷脂等营养因子，因此其具有降血压，预防癌症、糖尿病和肥胖，改善体质以及增强机体抗病能力等许多重要的生理功能。正因如此，大豆及其制品深受广大消费者的青睐，其需求量也逐年上升。然而，大豆又是八大过敏食物之一，据报道大

5、豆过敏患者约占食物过敏总人数的25，且多数患者为儿童，其中，大豆过敏儿童约占儿童过敏总人数的6。据最新研究表明90的大豆过敏反应都是由IGE介导而引发，而且尚未有大豆过敏的特效疗法。因此为了降低大豆过敏的危害，利用食物加工的方法来降低甚至去除大豆中的主要致敏成分，开发低致敏的大豆产品，越来越受到消费者的关注。0003大豆中蛋白质按照沉降系数分为2S、7S、11S和15S蛋白。在7S蛋白中，伴大豆球蛋白含量最高，约占7S蛋白85；同时，伴大豆球蛋白中的亚基又是大豆主要过敏原之一。研究表明，伴大豆球蛋白是一种糖蛋白，其碳水化合物约占糖蛋白含量的45。7S蛋白组分中还存在着两个低丰度蛋白GLYMBD

6、30K和GLYMBD28K，这两种蛋白是糖蛋白，也是大豆中主要过敏蛋白。由此可知，7S蛋白中含有大豆三大主要过敏原，且均为糖蛋白。0004目前，大豆蛋白常用的脱敏技术包括物理法、化学法、基因工程法和酶处理法等。物理法主要包括热处理、高压、剪切力、辐照等，这些处理方式会对食物的质构、营养等产生不利影响；化学法又易对食物造成污染；基因工程法虽然可去除大豆致敏原的内源基因，但是这些蛋白的缺失很可能会直接影响大豆植株的生长及其它相关的生理特性，而且转基因食物的安全性仍然存在广泛争议。0005超声波瞬间产生的空化作用使能量高度聚集，并在瞬间产生高温、高压等一系列极端的物理效应，从而对蛋白的空间结构产生影

7、响。如超声波处理促使大豆KUNITZ胰蛋白酶抑制剂分子中二硫键断裂，巯基和折叠含量明显增高，转角和不规则卷曲含量则会降低，从而引起二级结构的变化。超声波能影响蛋白的空间结构，但其作用力微弱，在降低食物致敏性作用方面并不十分显著，常辅助其它方法用于降低过敏食物的致敏性。酶解法是一种最为常用的脱敏方法，其主要通过破坏过敏蛋白的某些致敏表位的作用，从而降低或者消除过敏蛋白致敏性。迄今为止，酶解法降低或消除过敏原的致敏性大多数都是针对过敏蛋白，而针对过敏蛋白（糖蛋白）表面的多糖鲜有研究。发明内容0006本发明的目的是提供一种超声辅助酶解去糖基化制备低致敏大豆7S蛋白的方法。说明书CN104164464

8、A2/4页40007本发明所采取的技术方案如下。0008（1）称取一定质量的新鲜干大豆，研磨成粉末，脱脂风干，按照常规方法提取大豆7S蛋白。0009（2）将步骤（1）中所提取的大豆7S蛋白在水浴超声装置中超声处理，超声功率为300500W，时间为60MIN，然后向大豆7S蛋白溶液中加入005（KG/L）十二烷基磺酸钠（SDS）、01（KG/L）巯基乙醇，在100加热10MIN，将蛋白浓度稀释至1G/L，加入糖苷酶，酶解温度37，酶添加量2001000U/MG蛋白，震荡速度300RPM，时间2436H，期间保持反应体系相对稳定，反应结束后在100灭酶10MIN，快速冷却反应液。0010所述的糖苷

9、酶为肽N糖苷酶F（PNGASEF）、内切糖苷酶H（ENDOGLYCOSIDASEH，ENDOH）、内切乙酰葡萄糖胺苷酶（ENDOACETYLGLUCOSAMINIDASEF3，ENDOF3）或糖肽酶A（GLYCOPEPTIDASEA）中的任意一种。0011（3）将步骤（2）中所得的酶解液在80预冻12H，然后在冷冻温度为65、真空度100PA、加热板温度50条件下，真空冷冻干燥，至水分含量5，所得粉末即为低致敏大豆7S蛋白。0012本发明提供了一种在保证蛋白营养价值和功能特性的前提下，建立超声波辅助酶解去糖基化降低甚至消除过敏蛋白（糖蛋白）致敏性的方法。由于超声波预处理可以通过影响氢键、疏水作

10、用等来改变蛋白的三级结构，有利于亚基与糖苷酶充分接触。将超声辅助糖苷酶去糖基化处理可以显著降低大豆7S蛋白的致敏性。0013本发明的优点1、本发明所采用超声辅助糖苷酶去糖基化技术操作简单、条件温和、易于控制，且安全、经济。2、本发明得到的产品致敏性低，且7S蛋白功能特性基本不受影响，营养价值高，能满足大豆过敏患者的消费需求，具有良好的推广和应用前景，可用于食品、药品和化妆品等领域。具体实施方式0014本发明将通过以下具体实施例作进一步说明。0015实施例1。0016（1）称取5KG的新鲜干大豆，研磨成粉末，在研磨的过程中不断加入液氮。与正己烷按115（KG/L）脱脂3H，后于4C9,000G离

11、心30MIN，弃上清，重复该脱脂操作三次，最后一次脱脂过夜，离心所得到的脱脂大豆粉在通风橱中挥发去除正己烷后备用。0017（2）提取大豆7S蛋白具体步骤如下。0018A脱脂大豆粉按115（KG/L）溶于005MPH80TRISHCL缓冲液中震荡提取2H，离心取上清液备用，沉淀再重复浸提操作一次，混合两次离心所得上清液。0019B向混合液中加入亚硫酸氢钠（001M），用1MHCL调PH至64，在4C层析柜中搅拌过夜。0020C离心得上清液，向上清液中加入NACL（025M），1MHCL调PH至55，搅拌1H。0021D离心得上清液，1MHCL调上清液PH至50，搅拌1H。0022E离心得上清液，

12、向上清液中加入两倍体积的冰双蒸水，1MHCL调PH至48。0023F离心得到沉淀，用双蒸水洗涤沉淀，重复三次，后将沉淀复溶于PH80，005MTRISHCL缓冲液，透析24H，即得大豆7S蛋白。说明书CN104164464A3/4页50024（3）将步骤（2）所提的蛋白在水浴超声处理装置（40KHZ，300W）中超声60MIN。0025（4）将步骤（3）超声处理后的样品进行酶解去糖基化处理，加入005（KG/L）SDS和01（KG/L）巯基乙醇100加热10MIN，将蛋白浓度稀释至1G/L，按400U/MG蛋白的量向糖蛋白中加入PNGASEF除去蛋白表面的多糖，酶解温度为37，以300RPM震

13、荡24H，反应结束后在100灭酶10MIN，快速冷却反应液，然后4C5,000G，20MIN离心分离得到上清液，即为酶解去糖基化后的7S蛋白液。0026（5）将步骤（4）所得去糖基化的7S蛋白液真空冷冻干燥，至水分含量5，所得粉末即为低致敏大豆7S蛋白。0027实施例2。0028（1）称取2KG的新鲜干大豆，研磨成粉末，在研磨的过程中不断加入液氮。与正己烷按115（KG/L）脱脂3H，后于4C9,000G离心30MIN，弃上清，重复该脱脂操作三次，最后一次脱脂过夜，离心所得到的脱脂大豆粉在通风橱中挥发去除正己烷后备用。0029（2）提取大豆7S蛋白具体步骤同实例1。0030（3）将步骤（2）所

14、提的蛋白在水浴超声处理装置（40KHZ，400W）中超声60MIN。0031（4）将步骤（3）超声处理后的样品进行酶解去糖基化处理，加入005（KG/L）SDS和01（KG/L）巯基乙醇100加热10MIN，将7S蛋白样品稀释至1G/L，按1000U/MG蛋白的量向糖蛋白中加入ENDOH酶解温度为37，以300RPM震荡36H，反应结束后在100灭酶10MIN，快速冷却反应液，然后4C5,000G，20MIN离心分离得到上清液，即为酶解去糖基化后的7S蛋白液。0032（5）将步骤（4）所得的去糖基化的7S蛋白液真空冷冻干燥，至水分含量5，所得粉末即为低致敏大豆7S蛋白。0033实施例3。003

15、4（1）称取4KG的新鲜干大豆，研磨成粉末，在研磨的过程中不断加入液氮。与正己烷按115（KG/L）脱脂3H，后于4C9,000G离心30MIN，弃上清，重复该脱脂操作三次，最后一次脱脂过夜，离心所得到的脱脂大豆粉在通风橱中挥发去除正己烷后备用。0035（2）提取大豆7S蛋白具体步骤同实例1。0036（3）将步骤（2）所提的蛋白在水浴超声处理装置（40KHZ，500W）中超声60MIN。0037（4）将步骤（3）超声处理后的样品进行酶解去糖基化处理，加入005（KG/L）SDS和01（KG/L）巯基乙醇100加热10MIN，将7S蛋白样品稀释至1G/L，按200U/MG蛋白的量向糖蛋白中加入E

16、NDOF3控制温度37，以300RPM震荡36H，反应结束后在100灭酶10MIN，快速冷却反应液，然后4C5,000G，20MIN离心分离得到上清液，即酶解去糖基化后的7S蛋白液。0038（5）将步骤（4）所得的去糖基化的7S蛋白液真空冷冻干燥，至水分含量5，所得粉末即为低致敏大豆7S蛋白。0039实施例4。0040（1）称取10KG的新鲜干大豆，研磨成粉末，在研磨的过程中不断加入液氮。与正己烷按115（KG/L）脱脂3H，后于4C9,000G离心30MIN，弃上清，重复该脱脂操作三次，最后一次脱脂过夜，离心所得到的脱脂大豆粉在通风橱中挥发去除正己烷后备用。0041（2）提取大豆7S蛋白具体

17、步骤同实例1。说明书CN104164464A4/4页60042（3）将步骤（2）所提的蛋白在水浴超声处理装置（40KHZ，400W）中超声60MIN。0043（4）将步骤（3）超声处理后的样品进行酶解去糖基化处理，加入005（KG/L）SDS和01（KG/L）巯基乙醇100加热10MIN，将7S蛋白样品稀释至1G/L，按600U/MG蛋白的量向糖蛋白中加入GLYCOPEPTIDASEA，控制温度37，以300RPM震荡30H，反应结束后在100灭酶10MIN，快速冷却反应液，然后4C5,000G，20MIN离心分离得到上清液，即为酶解去糖基化后的7S蛋白液。0044（5）将步骤（4）所得的去糖基化的7S蛋白液真空冷冻干燥，至水分含量5，所得粉末即为低致敏大豆7S蛋白。说明书CN104164464A