一种红海榄根际纤维素降解真菌新种HYPOXYLONSPDPZSYZ36及其应用.pdf

1、10申请公布号CN102337222A43申请公布日20120201CN102337222ACN102337222A21申请号201110303628522申请日20110930CGMCCNO487220110516C12N1/14200601C12N9/42200601C05F11/08200601C12R1/64520060171申请人中国科学院南海海洋研究所地址510301广东省广州市新港西路164号72发明人董俊德潘虎张燕英凌娟陈蕾张偲龙丽娟74专利代理机构广州科粤专利商标代理有限公司44001代理人刘明星余炳和54发明名称一种红海榄根际纤维素降解真菌新种HYPOXYLONSPDPZS

2、YZ36及其应用57摘要本发明公开了一种红海榄根际纤维素降解真菌新种HYPOXYLONSPDPZSYZ36及其应用。炭团菌HYPOXYLONSPDPZSYZ36于2011年05月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号CGMCCNO4872。该菌具有产纤维素酶活性，可用于生产纤维素酶，因此对纤维素酶的生产和利用具有重要的价值。进一步可以用于制作生物有机质降解菌肥。83生物保藏信息51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表3页附图2页CN102337233A1/1页21一种炭团菌HYPOXYLONSPDPZSYZ

3、36，其保藏编号为CGMCCNO4872。2权利要求1所述的炭团菌HYPOXYLONSPDPZSYZ36在产纤维素酶中的应用。3权利要求1所述的炭团菌HYPOXYLONSPDPZSYZ36在制备生物有机质降解菌肥中的应用。权利要求书CN102337222ACN102337233A1/6页3一种红海榄根际纤维素降解真菌新种HYPOXYLONSPDPZSYZ36及其应用技术领域0001本发明属于生物技术领域，具体涉及一种红海榄根际纤维素降解真菌新种HYPOXYLONSPDPZSYZ36及其在生产纤维素酶和制备生物有机质降解菌肥中的应用。背景技术0002红树林为自然分布于热带、亚热带海岸潮间带的木本

4、植物群落，覆盖大约6075热带和亚热带海岸，对维护海湾河口的生态平衡起重要作用，是海洋生产力的重要组成部分HOLGUINETAL，2001；龙寒等，2005，被认为是具有较高生产力的生态系统之一。该生态系统具有较高的有机质水平全球每年凋落物为100TGC，为毗连的沿岸水域和相关的生物群落生境提供有机物HOLGUINETAL，2001；LUGOMELAANDBERGMAN，2002。由于红树林沉积物具有强还原性、强酸性、高含盐量、营养丰富TAKEUCHIMETAL，1998；林鹏，1997等特征。因此，这里蕴涵了大量独特的微生物、酶和基因资源。近年，红树林独特的生态环境和丰富的物种多样性引起了更

5、多海洋科学工作者的关注。但红树林区的微生物学研究起步较晚，研究较为薄弱。目前，红树林区微生物学研究主要集中在红树林微生物区系研究；凋落物分解过程中的微生物学研究；红树林根际放线菌研究；红树林区微生物污染生态学研究YUANKPETAL，2005；MUNISWARANAETAL1994。0003随着化石燃料的短缺，能源是人类面临的重大问题。寻找和开发可再生能源和新能源关系到经济的可持续发展乃至人类的生存问题。纤维素与石化燃料不同，它是一种可再生的资源。地球上每年光合作用可产生大约100亿吨的植物干物质，其中一半以上是纤维素和半纤维素CAMPBELLBAETAL，1998。另外，人类活动产生的废弃物

6、中也含有大量的纤维素物质，如农业废弃物稻草、稻壳、秸秆、花生壳、玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣等、食品加工废弃物果皮、果渣等、木材废弃物木屑、树皮以及城市废弃物4060固体废物是垃圾和废纸等。如果能有效地利用生物转化技术将这些纤维素资源转化成简单糖，再发酵产生乙醇等能源物质，不仅可以变废为宝，而且还可以避免由于化石燃料燃烧所带来的环境污染，同时可以缓解或解决石化能源短缺乃至枯竭所带来世界性能源危机。0004由于微生物在纤维素利用方面的独特优势，寻找新的纤维素利用菌种和开发高产纤维素酶菌种，是纤维素资源高效利用的关键。能够利用和分解纤维素的物种不仅有真核微生物如绿色木霉TVIRID、黑曲霉ASPERGI

7、LLUSNIGER和里氏木霉TRICHOGERMAREESEI等主要产纤维素酶的真菌，其中木霉属是研究最广泛的纤维素酶产生菌，世界纤维素酶市场中20的纤维素酶来自木霉属和曲霉属，但近年来，新的纤维素降解菌株的研究报道也日渐增多MARIOCNSETAL，2008；REVANKARMSETAL，2006。另外，还有一些原生动物和细菌也能分解纤维素类物质，但由于细菌分泌的纤维素酶量少，而且产生的酶属胞内酶或者吸附于细胞壁上，故工业上较少用细菌做纤维素酶的生产菌种。此外，有的动物如白蚁、小龙虾等也能产生完全不同于其内共生微生物群落所产的纤维素酶。由于纤维素降解真菌在能源利用方面有着其重要的作用，为此很

8、多科学工作者对这类真菌进行了大说明书CN102337222ACN102337233A2/6页4量的研究并取得了显著的成果。发明内容0005本发明的第一个目的是提供一种从中国海南省三亚市红海榄植物根际沉积物中筛选出的，具有较高的纤维素降解活性的真菌新种炭团菌HYPOXYLONSPDPZSYZ36，该菌于2011年05月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCCNO4872。0006本发明的红海榄根际纤维素降解真菌新种炭团菌HYPOXYLONSPDPZSYZ36，是从中国海南省三亚市红海榄植物根际

9、沉积物中筛选出的。0007其菌学特性描述如下0008菌种描述如图1所示，菌株营养菌丝壁光滑，具分隔，分枝，宽1536M。未见任何类型孢子。麦芽汁琼脂培养基上菌落生长较快，25黑暗条件下14天菌落直径4045MM，白色，絮状，气生菌丝茂盛；菌落背面中到暗褐色，无水溶性色素，对多种抗生素有明显抗性。将该菌株接种到以羧甲基纤维素钠CMCNA为主要碳源的平板上，在30培养3天后，可形成直径19MM的水解透明圈图1D，表明该菌株具有较高的纤维素等生物质降解活性。0009常规方法从炭团菌HYPOXYLONSPDPZSYZ36的纯培养物提取基因组DNA，运用RDNA内转录间隔区ITS序列特定的引物ITS1/

10、ITS4，通过PCR扩增和测序分析得到ITS序列，其序列如SEQIDNO1所示。运用微管蛋白TUBULIN序列特定的引物BT2A/BT2B，通过PCR扩增和测序分析得到TUBULIN序列，其序列如SEQIDNO2所示。运用28SRDNA序列特定的引物LROR/LR7，通过PCR扩增和测序分析得到28SRDNA序列，其序列如SEQIDNO3所示。通过GENBANK中的BLAST软件将ITS序列、TUBULIN序列和28SRDNA序列与GENBANK数据库中的序列进行比对，在数据库中没有找到完全相似的序列，表明这3条基因序列为首次发现的新基因序列。0010在GENBANK数据库中选取了部分与测定序

11、列相似性较高的代表性基因序列，通过CLUSTALW软件和MEGA软件以NEIBORJOINING方法构建系统进化树见图2、3、4，进行系统发育分析。从系统发育树可以看出炭团菌HYPOXYLONSPDPZSYZ36与已知的真菌具有较大的差异性。其RDNA内转录间隔区ITS序列测序分析表明与其亲缘关系较近的HYPOXYLONMONTICULOSUMFM2094671序列相似性达到99，与HYPOXYLONSPDQ6319391序列相似性达到98；但其微管蛋白TUBULIN序列除与HYPOXYLONMONTICULOSUMAY9517371具有97的相似性外，与其他菌株的相似性都小于90。另外，与其

12、28SRDNA序列亲缘关系最近的一株内生真菌EF4200881序列相似性只有96，它在进化树中单独形成一个分支。结合其形态学特征，我们将其归入炭团菌属HYPOXYLON，是一株炭团菌属的新种，命名为炭团菌HYPOXYLONSPDPZSYZ36。0011对菌株HYPOXYLONSPDPZSYZ36的纤维素酶活CMC酶活研究表明炭团菌HYPOXYLONSPDPZSYZ36在30、PH70条件下，液体发酵，发酵液的纤维素酶活在10天左右达到1211U/L图5。同时用含有HYPOXYLONSPDPZSYZ36的菌液制剂进行红海榄树叶降解试验。结果表明经过10天的降解处理红海榄树叶失重率达到689，由此

13、说说明书CN102337222ACN102337233A3/6页5明HYPOXYLONSPDPZSYZ36具有较好的纤维素等生物质降解活性。因此本发明的第二个目的是提供炭团菌HYPOXYLONSPDPZSYZ36在产纤维素酶中的应用。0012本发明的第三个目的是提供炭团菌HYPOXYLONSPDPZSYZ36在制备生物有机质降解菌肥中的应用。0013本发明提供了一种红海榄根际纤维素降解真菌新种炭团菌HYPOXYLONSPDPZSYZ36，该菌具有产纤维素酶活性，可用于生产纤维素酶，因此对纤维素酶的生产和利用具有重要的价值。进一步可以用于制作生物有机质降解菌肥。0014本发明的炭团菌HYPOXY

14、LONSPDPZSYZ36于2011年05月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCCNO4872。附图说明0015图1是HYPOXYLONSPDPZSYZ36菌落在麦芽汁培养基上生长情况A、光学显微镜照片B和C以及HYPOXYLONSPDPZSYZ36菌落在CMC刚果红平板上脱色情况D；0016图2是HYPOXYLONSPDPZSYZ36在RDNA内转录间隔区ITS无根系统发育树中位置图；0017图3是HYPOXYLONSPDPZSYZ36在微管蛋白TUBULIN无根系统发育树中位置图；00

15、18图4是HYPOXYLONSPDPZSYZ36在28SRDNA无根系统发育树中位置图；0019图5是HYPOXYLONSPDPZSYZ36液体发酵纤维素酶活CMC酶活图。具体实施方式0020以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。0021实施例100221、材料002311土样采集0024样品与2010年9月采自海南省三亚市红沙河沿岸红树林区红海榄RHIZOPHORASTYLOSA根际沉积物，样品采集后装入灭菌的封口聚乙烯袋中，带回实验室4低温保存。002512培养基0026121初筛培养基0027每升初筛培养基的配制方法如下马铃薯汁马铃薯去皮，挖芽眼，洗净，切片。称200G

16、放入1000ML自来水中，用文火煮沸30MIN，双层纱布过滤，滤液加水补至1000ML800ML，蔗糖，200G；NACL，15G；琼脂，15G，土壤浸提液，200ML；121灭菌后等培养基冷却至60加入过滤除菌的100G/ML的氨苄青霉素和100G/ML的硫酸链霉素各1ML。0028122复筛培养基G/L0029每升复筛培养基的配制方法如下CMCNA100G；蛋白胨05G；酵母提取物05G；蔗糖05G；KNO310G；K2HPO405G；MGSO47H2O05G；NACL15G；琼脂15G，水1000ML。121灭菌备用。说明书CN102337222ACN102337233A4/6页6003

17、0123保藏培养基0031每升保藏培养基的配制方法如下马铃薯汁马铃薯去皮，挖芽眼，洗净，切片。称200G放入1000ML自来水中，用文火煮沸30MIN，双层纱布过滤，滤液加水补至1000ML1000ML，蔗糖，200G；NACI，15G；琼脂，15G。121灭菌备用。0032124发酵培养基0033每升发酵培养基的配制方法如下CMCNA50G；蛋白胨10G；酵母提取物10G；蔗糖10G；KNO310G；K2HPO405G；MGSO47H2O05G；NACL15G；水1000ML。121灭菌备用。0034125红海榄树叶降解实验培养基0035每升红海榄树叶降解实验培养基的配制方法如下蛋白胨05G

18、，酵母粉10G，蔗糖05G，可溶性淀粉05G，红海榄树叶33G，NACL20G，CACO310G，MGSO410G，水1000ML。121灭菌备用。00362、方法003721菌株的分离筛选0038从样地选取三株红海榄RHIZOPHORASTYLOSA，采集它们的根际沉积物样品50G，将三份样品混匀后取约5G置于含50ML灭菌蒸馏水的三角瓶中37、150R/MIN震荡摇匀15MIN，静置30SEC后取1ML的液体梯度稀释至103、104、105，接种量为005ML，涂布于初筛培养基上，每一处理设8个重复。37培养35天，挑取形态典型的单一菌落进行点接纯化23次得到纯培养物。将得到纯培养物接种到

19、复筛培养基上，30倒置培养3天，在长出菌落的培养基上，覆盖质量浓度为1MG/ML的刚果红溶液1015MIN后，倒去刚果红溶液，再加入浓度为1MOL/L的NACL溶液，15MIN后倒掉NACL溶液，此时，产生纤维素酶的菌落周围将会出现透明圈。根据初步脱色效果辨别具有产纤维素酶的菌株，测量透明圈直径和菌落直径，筛选效果较好的菌株进行下一步研究。由此而获得一株菌株纯培养物，命名为DPZSYZ36，将其保存于保藏培养基中。003922菌株形态学特征鉴定0040菌株的形态学特征及初步的鉴定依据真菌鉴定手册。0041上一步骤筛选得到的菌株DPZSYZ36，其菌种形态学特征描述如下如图1所示，菌株营养菌丝壁

20、光滑，具分隔，分枝，宽1536M。未见任何类型孢子。麦芽汁琼脂培养基上菌落生长较快，25黑暗条件下14天菌落直径4045MM，白色，絮状，气生菌丝茂盛；菌落背面中到暗褐色，无水溶性色素，对多种抗生素有明显抗性。将该菌株接种到以羧甲基纤维素钠CMCNA为主要碳源的平板上，在30培养3天后，可形成直径19MM的水解透明圈图1D，表明该菌株具有较高的纤维素等生物质降解活性。004223菌株分子生物学鉴定0043对获得的纯培养物菌株DPZSYZ36使用上海生工公司基因组抽提试剂盒提取DNA，然后用于目的基因的扩增。0044真菌ITS区部分序列的扩增采用通用引物ITS1/ITS4TJWHITE，TBRU

21、NS，ETAL19900045ITS15TCCGTAGGTGAACCTGCGG3，0046ITS45TCCTCCGCTTATTGATATGC3。说明书CN102337222ACN102337233A5/6页70047微管蛋白TUBULIN序列的扩增采用通用引物BT2A/BT2BGLASSDONALDSON，19950048BT2A5GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC3，0049BT2B5ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC3；005028SRDNA序列的扩增采用通用引物LROR/LR7VILGALYS，RMHESTER19900051LROR5ACCCGCTGAACT

22、TAAGC3，0052LR75TACTACCACCAAGATCT3。0053PCR反应体系和反应条件如下0054PCR反应体系包括PCR反应程序是00550056取2LPCR产物，1琼脂糖电泳进行产物检测。扩增产物经纯化后，送交测序公司测序。运用RDNA内转录间隔区ITS序列特定的引物ITS1/ITS4，通过PCR扩增和测序分析得到ITS序列，其序列如SEQIDNO1所示。运用微管蛋白TUBULIN序列特定的引物BT2A/BT2B，通过PCR扩增和测序分析得到TUBULIN序列，其序列如SEQIDNO2所示。运用28SRDNA序列特定的引物LROR/LR7，通过PCR扩增和测序分析得到28SR

23、DNA序列，其序列如SEQIDNO3所示。通过GENBANK中的BLAST软件将ITS序列、TUBULIN序列和28SRDNA序列与GENBANK数据库中的序列进行比对，在数据库中没有找到完全相似的序列，表明这3条基因序列为首次发现的新基因序列。0057在GENBANK数据库中选取了部分与测定序列相似性较高的代表性基因序列，通过CLUSTALW软件和MEGA软件以NEIBORJOINING方法构建系统进化树见图2、3、4，进行系统发育分析。从系统发育树可以看出炭团菌HYPOXYLONSPDPZSYZ36与已知的真菌具有较大的差异性。其RDNA内转录间隔区ITS序列测序分析表明与其亲缘关系较近的

24、HYPOXYLONMONTICULOSUMFM2094671序列相似性达到99，与HYPOXYLONSPDQ6319391序列相似性达到98；但其微管蛋白TUBULIN序列除与HYPOXYLONMONTICULOSUMAY9517371具有97的相似性外，与其他菌株的相似性都小于说明书CN102337222ACN102337233A6/6页890。另外，与其28SRDNA序列亲缘关系最近的一株内生真菌EF4200881序列相似性只有96，它在进化树中单独形成一个分支。结合其形态学特征，我们将其归入炭团菌属HYPOXYLON，是一株炭团菌属的新种，命名为炭团菌HYPOXYLONSPDPZSYZ3

25、6。005824纤维素酶活CMC酶活的测定0059将炭团菌HYPOXYLONSPDPZSYZ36接种于250ML发酵培养基中，30、PH70条件下，每天取少量的发酵液测定发酵液的纤维素酶活性。发酵液经6000R/MIN离心10MIN，上清液作为粗酶液。于25ML的具塞刻度玻璃试管中加入05ML适当稀释的酶液，50恒温水浴预热2MIN后，加入20ML用PH48醋酸缓冲液配制的1羧甲基纤维素钠溶液，50恒温水浴酶解30MIN，然后加入25ML的DNS于沸水浴中5MIN，流水冷却后定容至25ML混匀，在520NM下测定其吸光值，对照标准曲线后测算酶活力。发酵液的酶活如图5所示，由图5可知，发酵液具有

26、纤维素酶活性，随着发酵时间的延长，其纤维素酶活性逐渐升高，10天左右发酵液的纤维素酶活达到1211U/L。由此表明本发明的炭团菌HYPOXYLONSPDPZSYZ36具有产纤维素酶活性。0060酶活力按照国际单位规定定义为每分钟催化纤维素水解生成1MOL葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位U。006125炭团菌HYPOXYLONSPDPZSYZ36的红海榄树叶降解试验0062将炭团菌HYPOXYLONSPDPZSYZ36接种到固体PDA平板上，等菌落长到一定大小后用6CM打孔器取三块菌苔接种分别接种到三瓶含有250ML的红海榄树叶降解实验培养基中，静置培养10天，红海榄树叶失重率达到689，由此说明炭团菌HYPOXYLONSPDPZSYZ36菌株具有较好的纤维素等生物质降解活性。说明书CN102337222ACN102337233A1/3页900010002序列表CN102337222ACN102337233A2/3页100003序列表CN102337222ACN102337233A3/3页11序列表CN102337222ACN102337233A1/2页12图1图2说明书附图CN102337222ACN102337233A2/2页13图3图4图5说明书附图CN102337222A