基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010875746.2 (22)申请日 2020.08.27 (71)申请人 合肥海关技术中心 地址 230000 安徽省合肥市屯溪路329号 (72)发明人 郑海松叶永康孙娟娟李云飞 宗凯余晓峰 (74)专利代理机构 合肥超通知识产权代理事务 所(普通合伙) 34136 代理人 余红 (51)Int.Cl. G01N 27/327(2006.01) G01N 27/48(2006.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C1

2、2Q 1/10(2006.01) C12R 1/42(2006.01) (54)发明名称 一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏 菌检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于DNA电化学传感器的 食品中沙门氏菌检测方法， 提取沙门氏菌中DNA， 以invA引物进行PCR， 产物进行琼脂糖凝胶电泳 检测， 扩增PCR产物， 同时使用DNA电化学传感器 对PCR产物进行检测， 有效检测PCR产物， 即可用 DNA电化学传感器成功有效地检测样品中沙门氏 菌。 实验通过循环伏安法和电化学阻抗法对组装 过程进行表征， 并通过差分脉冲伏安法进行可行 性分析， 探究出实验最佳反应条件， 对沙门氏菌 in

3、vA基因片段进行检测， 从而达到对沙门氏菌的 快速、 精确检测。 权利要求书2页 说明书6页 附图1页 CN 111999365 A 2020.11.27 CN 111999365 A 1.一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法， 其特征在于： 包括以下步 骤： (1)食品中沙门氏菌培养； (2)沙门氏菌DNA提取； (3)PCR扩增； (4)凝胶电泳； (5)使用DNA电化学传感器检测沙门氏菌。 2.根据权利要求1所述的一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法， 其特 征在于： 培养食品中的沙门氏菌， 提取沙门氏菌中DNA， 以invA引物进行PCR， 产物进行琼脂 糖

4、凝胶电泳检测， 扩增PCR产物， 同时使用DNA电化学传感器对PCR产物进行检测， 有效检测 PCR产物， 即可用DNA电化学传感器成功有效地检测样品中沙门氏菌。 3.根据权利要求2所述的一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法， 其特 征在于： 扩增PCR产物指的是扩增284bp大小的PCR产物。 4.根据权利要求1所述的一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法， 其特 征在于： 所述的用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法， 包括以下步骤： (1)电极预处理； (2)电极组装； 首先， 滴加5-6 L浓度1.0mg/mL-1聚吡咯-还原氧化石墨烯PPy-rGO溶

5、液到预处理后的 电极表面， 将电极置于干燥器中， 静置1.8-2.2h， 获得聚吡咯-还原氧化石墨烯修饰电极 PPy-rGO/GCE； 将聚吡咯-还原氧化石墨烯修饰电极PPy-rGO/GCE置于浓度为3-4mM的HAuCl4与浓度为 0.1M KNO3的混合溶液中， 在恒定电位-0.2V下电沉积50-55s， 用超纯水洗涤电极， 用N2吹干， 得到金纳米粒子修饰后电极depAuNP/PPy-rGO/GCE； 用移液器取5-6 L的10 M cDNA滴加到 所得电极表面， 放置11-12小时， 之后电极依次用浓度0.1的SDS溶液和pH 7.4的10mM的 Tris-HCl缓冲液洗去未结合在电极

6、表面的探针， 待电极表面干燥后滴加浓度2的BSA溶液 100-110 L， 放置58-62min以消除非特异性吸附， 得到的DNA传感界面BSA/cDNA/depAuNP/ PPy-rGO/GCE电极； 将100-110 L浓度为100pM的tDNA与10-11 L的浓度为10 M的bio-DNA溶液混合均匀， 将 上述DNA传感界面BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE电极浸泡在此溶液中， 36-38下温育1- 1.1h， 得到bio-DNA/tDNA/BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE电极； 之后再在所得电极上滴加亲和素-辣根过氧化物酶修饰的金纳米粒

7、子AuNPs-HRP-SA复 合物5-6 L， 室温下放置30-32min， Tris-HCl缓冲液清洗并用N2吹干得到AuNPs-HRP-SA/ bio-DNA/tDNA/BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE， 即得。 5.根据权利要求4所述的一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法， 其特 征在于： 所述的电极预处理方法为： 首先将直径为3mm的玻碳电极用1200目SiC砂纸打磨1- 2min， 再依次用1.0、 0.3和0.05 m的Al2O3抛光至镜面； 再依次用1:1的硝酸水溶液、 1:1的乙 醇和超纯水超声清洗3-4min； 以5mM Fe(CN)63

8、-/4-溶液为底液， 将电极在-0.20.6V范围内 循环伏安获得一对可逆氧化还原峰， 当峰差小于80mV时， 说明电极表面清洁可用， 否则重新 权利要求书 1/2 页 2 CN 111999365 A 2 处理电极， 直到电极符合要求， 最后用二次蒸馏水清洗再用氮气吹干。 6.根据权利要求4所述的一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法， 其特 征在于： 所述浓度1.0mg mL-1聚吡咯-还原氧化石墨烯PPy-rGO溶液的制备方法包括以下步骤： (1)准确称取0.100g的氧化石墨烯溶解于100mL超纯水中， 配置浓度为1.0mg/mL-1的氧 化石墨烯悬浊液， 超声23-24h

9、， 悬浊液变为较均匀溶液， 转速3000-3100rpm离心10-12min， 取上清液， 得到均一稳定的溶液， 再用超纯水透析1周， 去除其它小分子， 最终得到1.0mg/ mL-1氧化石墨烯溶液； (2)取10-12mL 1.0mg/mL-1氧化石墨烯溶液于锥形瓶中， 匀速搅拌下加入150 L Py:GO 质量比为15:1的吡咯， 超声25-30min， 将浓度为1molL-1FeCl3溶液一滴一滴加入到溶液中， 使得n Fe3+:n Py1:1， 室温下搅拌23-24h， 原位聚合得到PPy-GO复合物， 用乙醇和超纯水 离心洗涤三次， 真空干燥得到固体粉末； (3)利用所得固体粉末配置

10、10mL 1.0mg/mL-1PPy-GO溶液， 随后缓慢加入100 L浓度为 28的氨水， 最后加入40 L浓度为25的水合肼， 将混合物剧烈搅拌25-30min， 然后在55- 60下中速搅拌反应15-16h， 得到的黑色溶液， 10000-11000rpm下离心25-30min， 弃去上清 液， 并将沉淀离心水洗3-4次， 之后将得到的PPy-rGO真空干燥， 制备1.0mg mL-1PPy-rGO溶 液， 3-4下储存备用， 即得。 7.根据权利要求4所述的一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法， 其特 征在于： 所述亲和素-辣根过氧化物酶修饰的金纳米粒子AuNPs-HRP

11、-SA复合物的制备方法 为： (1)用锥形瓶取100mL浓度为0.01的氯金酸溶液置于石棉网加热至沸腾， 加入3.5mL 浓度1柠檬酸钠， 迅速搅拌， 继续加热直至溶液颜色由浅黄色变为紫色， 最后变为酒红色， 停止加热， 待溶液冷却， 将制备好的金纳米粒子AuNPs溶液置于3-5冰箱备用； (2)取1mL制备好的AuNPs溶液于1.5mL离心管中， 10000-11000rpm下离心10-12min， 弃 去上清液， 用pH 7.4的PBS缓冲液重新定容至300 L， 完成AuNPs溶液的浓缩， 加入20 L浓度 0.1mg/mL-1SA-HRP溶液， 震荡均匀， 3-5放置23-25h， 之

12、后转速7500-8000rpm条件下离心 15-20min， 离心水洗三次后用缓冲液定容， 3-4条件下储存备用， 得到亲和素-辣根过氧化 物酶修饰的金纳米粒子AuNPs-HRP-SA复合物。 8.根据权利要求4所述的一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法， 其特 征在于： Tris-HCl缓冲液溶液的制备方法为:准确称取0.484g的Tris固体， 溶于超纯水中， 并用100mL容量瓶定容， 得到0.02M Tris溶液， 取50mL Tris溶液加入约42mL的0.02M HCl溶 液， 加超纯水至100mL， 用pH计对溶液pH校正， 得到pH 7.4的浓度为10mM的Tri

13、s-HCl缓冲溶 液。 9.根据权利要求4所述的一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法， 其特 征在于： ： 1mol L-1FeCl3溶液制备方法为： 称取2.703g FeCl36H2O颗粒溶解于10mL超纯水 中。 10.根据权利要求4所述的一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法， 其 特征在于： 所得的用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器在电化学检测后， 符合要求即可投 入使用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111999365 A 3 一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法 技术领域 0001 本发明涉及检测方法领域， 确切地说是一种基于DNA

14、电化学传感器的食品中沙门 氏菌检测方法。 背景技术 0002 沙门氏菌是引起人类食源性疾病的主要病原体之一， 由美国病理学家沙门最早发 现， 是具有共同特征的一大属革兰氏阴性肠道杆菌， 其入侵宿主细胞， 释放毒素， 并可在细 胞内快速繁殖， 包括两个种和六个亚种， 按抗原分类， 其已被发现超过2500种血清型。 沙门 氏菌有大范围食物污染的特点， 且发病率高， 人经口摄入受污染的肉类、 蛋类、 蔬菜后， 会引 起腹泻、 发烧、 肠胃炎、 菌血症、 伤寒肠热病等一系列疾病， 严重的会危及生命。 近年来， 沙门 氏菌感染病例不断增加， 严重威胁全人类健康， 给社会造成巨大经济损失和负担。 目前DN

15、A 生物传感器用于沙门氏菌检测主要包括质量敏感型、 热敏型、 光学、 电化学等类型， 而基于 核酸杂交原理的检测沙门氏菌invA基因的DNA生物传感器中， 电化学和化学发光DNA生物传 感器的应用最为广泛。 化学发光DNA传感器用于沙门氏菌检测有高的灵敏度， 但稳定性、 重 现性差， 探针和目标序列标记操作复杂， 成本昂贵。 DNA电化学传感器操作过程简单， 检测灵 敏、 精确、 快速， 易于集成化和微型化。 发明内容 0003 本发明的目的在于为了克服传统食品中沙门氏菌检测中存在的选择性差、 检测周 期长、 检测灵敏度低等缺点， 以提高检测方法的灵敏度和准确度的基于DNA电化学传感器的 食品

16、中沙门氏菌检测方法 0004 上述目的通过以下方案实现： 0005 一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法， 其特征在于： 包括以下步 骤： 0006 (1)食品中沙门氏菌培养； 0007 (2)沙门氏菌DNA提取； 0008 (3)PCR扩增； 0009 (4)凝胶电泳； 0010 (6)使用DNA电化学传感器检测沙门氏菌。 0011 所述的一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法， 其特征在于： 培养 食品中的沙门氏菌， 提取沙门氏菌中DNA， 以invA引物进行PCR， 产物进行琼脂糖凝胶电泳检 测， 扩增PCR产物， 同时使用DNA电化学传感器对PCR产物进行检测

17、， 有效检测PCR产物， 即可 用DNA电化学传感器成功有效地检测样品中沙门氏菌。 0012 所述的一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法， 其特征在于： 扩增 PCR产物指的是扩增284bp大小的PCR产物。 0013 所述的一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法， 其特征在于： 所述 说明书 1/6 页 4 CN 111999365 A 4 的用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法， 0014 包括以下步骤： 0015 (1)电极预处理； 0016 (2)电极组装； 0017 首先， 滴加5-6 L浓度1.0mg/mL-1聚吡咯-还原氧化石墨烯PPy-rGO

18、溶液到预处理 后的电极表面， 将电极置于干燥器中， 静置1.8-2.2h， 获得聚吡咯-还原氧化石墨烯修饰电 极PPy-rGO/GCE； 0018 将聚吡咯-还原氧化石墨烯修饰电极PPy-rGO/GCE置于浓度为3-4mM的HAuCl4与浓 度为0.1M KNO3的混合溶液中， 在恒定电位-0.2V下电沉积50-55s， 用超纯水洗涤电极， 用N2 吹干， 得到金纳米粒子修饰后电极depAuNP/PPy-rGO/GCE； 用移液器取5-6 L的10 M cDNA滴 加到所得电极表面， 放置11-12小时， 之后电极依次用浓度0.1的SDS溶液和pH 7.4的10mM 的Tris-HCl缓冲液洗

19、去未结合在电极表面的探针， 待电极表面干燥后滴加浓度2的BSA溶 液100-110 L， 放置58-62min以消除非特异性吸附， 得到的DNA传感界面BSA/cDNA/depAuNP/ PPy-rGO/GCE电极； 0019 将100-110 L浓度为100pM的tDNA与10-11 L的浓度为10 M的bio-DNA溶液混合均 匀， 将上述DNA传感界面BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE电极浸泡在此溶液中， 36-38下 温育1-1.1h， 得到bio-DNA/tDNA/BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE电极； 0020 之后再在所得电极上滴加亲

20、和素-辣根过氧化物酶修饰的金纳米粒子AuNPs-HRP- SA复合物5-6 L， 室温下放置30-32min， Tris-HCl缓冲液清洗并用N2吹干得到AuNPs-HRP- SA/bio-DNA/tDNA/BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE， 即得。 0021 所述的一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法， 其特征在于： 所述 的电极预处理方法为： 首先将直径为3mm的玻碳电极先用1200目SiC砂纸打磨1-2min， 再依 次用1.0、 0.3和0.05 m的Al2O3抛光至镜面； 再依次用1:1的硝酸水溶液、 1:1的乙醇和超纯水 超声清洗3-4min；

21、 以5mMFe(CN)63-/4-溶液为底液， 将电极在-0.20.6V范围内循环伏安获得 一对可逆氧化还原峰， 当峰差小于80mV时， 说明电极表面清洁可用， 否则重新处理电极， 直 到电极符合要求， 最后用二次蒸馏水清洗再用氮气吹干。 0022 所述的一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法， 其特征在于： 浓度 为1.0mgmL-1聚吡咯-还原氧化石墨烯PPy-rGO溶液制备方法包括以下步骤： 0023 (1)准确称取0.100g的氧化石墨烯溶解于100mL超纯水中， 配置浓度为1.0mg/mL-1 的氧化石墨烯悬浊液， 超声23-24h， 悬浊液变为较均匀溶液， 转速3000

22、-3100rpm离心10- 12min， 取上清液， 得到均一稳定的溶液， 再用超纯水透析1周， 去除其它小分子， 最终得到 1.0mg/mL-1氧化石墨烯溶液； 0024 (2)取10-12mL 1.0mg/mL-1氧化石墨烯溶液于锥形瓶中， 匀速搅拌下加入150 L Py:GO质量比为15:1的吡咯， 超声25-30min， 将浓度为1mol L-1FeCl3溶液一滴一滴加入到溶 液中， 使得n Fe3+:n Py1:1， 室温下搅拌23-24h， 原位聚合得到PPy-GO复合物， 用乙醇和超 纯水离心洗涤三次， 真空干燥得到固体粉末； 0025 (3)利用所得固体粉末配置10mL 1.0

23、mg/mL-1PPy-GO溶液， 随后缓慢加入100 L浓度 为28的氨水， 最后加入40 L浓度为25的水合肼， 将混合物剧烈搅拌25-30min， 然后在 55-60下中速搅拌反应15-16h， 得到的黑色溶液， 10000-11000rpm下离心25-30min， 弃去 说明书 2/6 页 5 CN 111999365 A 5 上清液， 并将沉淀离心水洗3-4次， 之后将得到的PPy-rGO真空干燥， 制备1.0mg mL-1PPy-rGO 溶液， 3-4下储存备用， 即得。 0026 所述的一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法， 其特征在于： 亲和 素-辣根过氧化物酶修饰

24、的金纳米粒子AuNPs-HRP-SA复合物的制备方法为： 0027 (1)用锥形瓶取100mL浓度为0.01的氯金酸溶液置于石棉网加热至沸腾， 加入 3.5mL浓度1柠檬酸钠， 迅速搅拌， 继续加热直至溶液颜色由浅黄色变为紫色， 最后变为酒 红色， 停止加热， 待溶液冷却， 将制备好的金纳米粒子AuNPs溶液置于3-5冰箱备用； 0028 (2)取1mL制备好的AuNPs溶液于1.5mL离心管中， 10000-11000rpm下离心10- 12min， 弃去上清液， 用pH 7.4的PBS缓冲液重新定容至300 L， 完成AuNPs溶液的浓缩， 加入 20 L浓度0.1mg/mL-1SA-HR

25、P溶液， 震荡均匀， 3-5放置23-25h， 之后转速7500-8000rpm条件 下离心15-20min， 离心水洗三次后用缓冲液定容， 3-4条件下储存备用， 得到亲和素-辣根 过氧化物酶修饰的金纳米粒子AuNPs-HRP-SA复合物。 0029 所述的一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法， 其特征在于： Tris-HCl缓冲液溶液的制备方法为:准确称取0.484g的Tris固体， 溶于超纯水中， 并用 100mL容量瓶定容， 得到0.02M Tris溶液， 取50mL Tris溶液加入约42mL的0.02M HCl溶液， 加超纯水至100mL， 用pH计对溶液pH校正，

26、得到pH7.4的浓度为10mM的Tris-HCl缓冲溶液。 0030 一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法， 其特征在于： ： 1mol L- 1FeCl3溶液制备方法为： 称取2.703g FeCl36H2O颗粒溶解于10mL超纯水中。 0031 一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法， 其特征在于： 所得的用于 沙门氏菌检测的DNA电化学传感器在电化学检测后， 符合要求即可投入使用。 0032 本发明的有益效果为： 0033 本发明公开了一种基于DNA电化学传感器的食品中沙门氏菌检测方法。 具体操作 步骤是： 通过柠檬酸还原法制备AuNPs， 通过Au-S键自组装

27、， 制备AuNPs-sDNA纳米复合探针， 通过紫外， XPS， 透射电镜对材料进行表征。 电极表面电沉积金纳米粒子， 负载cDNA， 并通过 三条DNA碱基互补杂交完成夹心结构式DNA电化学传感器的组装， 之后Ag+在sDNA胞嘧啶丰 富序列处还原形成AgNCs， 将AgNCs的电化学还原作为最终信号。 实验通过循环伏安法和电 化学阻抗法对组装过程进行表征， 并通过差分脉冲伏安法进行可行性分析， 探究出实验最 佳反应条件， 对沙门氏菌invA基因片段进行检测， 从而达到对沙门氏菌的快速、 精确检测。 附图说明 0034 图1为各DNA的峰平均电流值柱状图； 0035 图2为空白对照曲线(a)

28、及invA的PCR产物曲线(b)的DPV峰电流曲线图， 其中， DNA 浓度横轴与峰电流纵轴之间的曲线图； 0036 图3为invA的PCR产物电泳图。 (泳道1为标志物， 2为PCR产物， 3为空白对照) 具体实施方式 0037 溶液的配制 0038 1、 (1.1)Tris-HCL缓冲液溶液:准确称取0.484g的Tris固体， 溶于超纯水中， 并用 100mL容量瓶定容， 得到0.02M Tris溶液， 取50mL Tris溶液加入约42mL的HCL(0.02M)溶液， 说明书 3/6 页 6 CN 111999365 A 6 加超纯水至100mL， 用pH计对溶液pH校正， 得到pH

29、7.4的10mM Tris-HCL缓冲溶液。 0039 (1.2)Tris-HCl缓冲溶液(10mM Tris-HCl， 1.0mM EDTA， pH 7.4)来储存全部寡核 苷酸。 0040 (1.3)DNA固定缓冲液(10mM Tris-HCl， 1.0mM EDTA， 1.0mM TCEP， 100mM NaCl， 1.0mM MgCl2， pH 7.4)。 0041 (1.4)杂交缓冲液(10mM Tris-HCl， 1.0mM EDTA， 100mM NaCl， 1.0mM MgCl2， pH7.4)。 0042 (1.5)0.1M PBS溶液： 称取15.6g磷酸二氢钠， 用二蒸水

30、定容至1000mL， 得到0.1M磷 酸二氢钠溶液； 称取35.81g磷酸氢二钠， 用二蒸水定容至1000mL， 得到0.1M磷酸氢二钠溶 液， 将两种溶液按19： 81比例混合， 得到pH7.4的PBS缓冲液。 0043 (1.6)硝酸银(AgNO3)溶液： 称取0.0849g硝酸银于容量瓶中， 用超纯水定容至 100mL， 得到5mM L-1的AgNO3溶液； 0044 (1.7)硼氢化钠(NaBH4)溶液： 称取0.0473g硼氢化钠溶于柠檬酸钠缓冲液(pH7.0) 定溶100mL， 得到12.5mM L-1的NaBH4溶液。 0045 (1.8)3mM L-1 HAuCl4溶液(含0.

31、1M KNO3)： 称取0.1235g HAuCl44H2O， 1.011g KNO3于烧杯， 用容量瓶定容至100mL。 0046 2.AuNPs-DNA的制备 0047 (1)AuNPs制备 0048 用锥形瓶取100mL氯金酸溶液(0.01)置于石棉网加热至沸腾， 加入3.5mL柠檬酸 钠(1)溶液， 继续加热直至溶液颜色由浅黄色变为紫色， 最后变为酒红色， 将制备好的 AuNPs溶液置于冰箱备用。 0049 (2)AuNPs-sDNA制备 0050 300uL sDNA(10-5M)加入1.2mL制备好的AuNPs溶液中， 4震荡12h后， 将AuNPs- DNA置于Tris-HCl缓

32、冲液(0.1M NaCl,pH7.0)中老化24h， 转速8000r条件下离心15min， 离心 水洗三次后用缓冲液定容， 4条件下储存备用。 0051 3.DNA传感器制备 0052 (1)电极预处理 0053 首先将直径为3mm的玻碳电极依次用1.0、 0.3和0.05 m的Al2O3抛光至镜面。 再分别 用1:1的硝酸水溶液、 乙醇和超纯水超声清洗3min。 以5mM Fe(CN)63-/4-溶液为底液， 在-0.2 0.6V范围内循环伏安获得一对可逆氧化还原峰， 当峰差小于80mV时， 说明电极表面清洁 可用， 否则重新处理电极， 直到电极符合要求。 最后用二蒸水清洗再用氮气吹干。 0

33、054 (2)电极组装 0055 首先， 预处理后的电极浸入5mL的含3mM含0.1M KNO3的HAuCl4溶液， 在恒定的电位- 0.2V下电沉积70s获得金纳米粒子层修饰电极(depAuNP/GCE)。 用移液器取5 L的10 M cDNA 滴加到电极上， 在湿润环境下放置12小时， 电极分别用0.1SDS溶液和Tris-HCl缓冲液 (10mM， pH7.4)洗去未结合在电极表面的探针； 待电极表面干燥后滴加5 L 1mM MCH溶液， 放 置30min以消除非特异性吸附， 用80乙醇和蒸馏水冲洗干净， 得到的DNA传感界面MCH/ cDNA/depAuNPs/GCE； 将上述电极浸泡

34、在不同浓度tDNA杂交缓冲液中， 37下温育一定时 间， 之后用0.1SDS溶液和Tris-HCl缓冲液(10mM， pH 7.4)冲洗， 得到tDNA/MCH/cDNA/ 说明书 4/6 页 7 CN 111999365 A 7 depAuNPs/GCE； 电极浸泡在AuNPs-sDNA复合物溶液中37温育80min， 清洗并用N2吹干； 将5 L 5mM AgNO3溶液滴加在电极表面， 在黑暗中放置10min， 接下来， 12.5mM的硼氢化钠溶液5 L小心滴加在电极， 黑暗中放置50min。 最后对电极进行清洗， 然后进行电化学检测。 0056 4.实验测试方法 0057 X射线光电子能

35、谱(XPS)， 主要用于表征材料表面元素的构成。 x射线光电子能谱 (XPS)使用Al K (1486.6eV)为射线源， 辐射功率225W， 入射角为90 。 制样： 干燥得到粉末样 品进行检测。 0058 场发射透射电子显微镜(FETEM)电子枪： ZrO/W(100)Schottky热场发射电子枪。 加 速电压： 200kV。 制样： 将支持膜膜面朝上平放在滤纸上， 将待测样水溶液， 用移液枪滴加到 铜网上， 样品自然干燥后之后再重复滴两次， 将带有样品的铜网置于仪器中进行测试， 观察 试样表面形貌。 0059 场发射扫描电子显微镜(FESEM),二次电子探测器， 电子加速电压:1kV。

36、 0060 紫外-可见光谱(UV-Vis)测试范围250nm900nm， 样品池为1cm的容量为500 L的 狭缝石英比色皿。 0061 电化学检测： GCE作为工作电极， Ag/AgCl作为参比电极， 铂丝电极作为对电极的三 电极系统。 (1)采用循环伏安法(CV)、 电化学阻抗谱(EIS)在5.0mM(Fe(CN)6)3-/4-含0.1MKCl 的磷酸缓冲溶液中对电极组装过程进行表征， CV扫描范围为-0.3V到0.5V， 扫描速率为 50mV/s。 EIS频率： 0.1kHZ到100kHZ， 振幅： 5.0mV。 (2)采用微分脉冲伏安法(DPV)检测， 底液 为包含0.1M氯化钠的磷酸

37、缓冲溶液(pH7.4)， 初始电位： 0V， 终止电位： 0.3V， 电位增量4mV/ s,脉冲幅度50mV， 脉冲宽度为0.05s。 0062 5.选择性， 稳定性， 重复性 0063 为了研究该DNA生物传感器对tDNA识别性能， 使用100pM的tDNA， 单碱基错配DNA (Mis-1)， 三碱基错配DNA(Mis-3)， 完全不匹配DNA(N-DNA)4种DNA序列分别作为检测序列， 研究该DNA生物传感器的选择性。 实验得到Mis-1， Mis-3的峰电流值明显低于tDNA， N-DNA的 峰电流与blank接近， 由图1得到， Mis-1和Mis-3的相对峰值电流值(扣除空白值)

38、仅为tDNA 的42.1和15.8， 可以看出该传感器有良好的选择性。 0064 实验对DNA传感器的稳定性进行了研究， 该生物传感器在4条件下放置5天和10 天后， 响应信号分别保持了原信号的88.2和71.4， 通过三根不同的电极进行测试， 该传 感器的重现性， 其相对标准偏差(RSD)为5.05， 因此该电极有良好的稳定性和重复性。 0065 6.实际样品测定 0066 测定方法为： 培养食品中的沙门氏菌， 提取沙门氏菌中DNA， 以invA引物进行PCR， 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 扩增PCR产物， 同时使用DNA电化学传感器对PCR产物进行检 测， 有效检测PCR产物， 即可用D

39、NA电化学传感器成功有效地检测样品中沙门氏菌。 0067 为了评估所制造的生物传感器检测实际样品的可行性， 沙门氏菌中提取DNA， 以 invA引物进行PCR， 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 具有正确大小(284bp)的PCR产物显示在 图3中。 同时使用DNA电化学传感器对PCR产物进行检测， 得到图2中曲线b， 曲线a为空白对照 曲线， 显示了本方法可以成功有效地检测实际样品。 0068 7.样品测定 0069 提取沙门氏菌中DNA， 以invA引物进行PCR， 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 扩增大 说明书 5/6 页 8 CN 111999365 A 8 小(284bp)的PCR产物。

40、同时使用DNA电化学传感器对PCR产物进行检测， 能有效检测PCR产 物， DNA电化学传感器可以成功有效地检测样品中沙门氏菌。 我们使用AuNPs-sDNA纳米探针 利用富含胞嘧啶的寡核苷酸作为模板原位合成银纳米簇， 对沙门氏菌invA基因进行检测， 电化学信号和tDNA浓度之间的线性关系从1fM到0.1nM， 检测限低至0.162fM， 电化学传感方 法与其他方法相比具有高灵敏度(如表2)， 传感平台同时具有良好的选择性， 稳定性和重现 性。 因此， 该方法在检测沙门氏菌invA基因方面具有很好的应用潜力。 0070 表格1构建电化学传感方法与其他方法比较 0071 说明书 6/6 页 9 CN 111999365 A 9 图1 图2 图3 说明书附图 1/1 页 10 CN 111999365 A 10